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銀杏黃酮對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠的作用
作者：竇麗華，馬玉奎，丁元升
【摘要】 目的 研究銀杏黃酮對(duì)D-半乳糖所致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降和各項(xiàng)衰老指標(biāo)的對(duì)抗作用，以期探討銀杏黃酮的抗衰老作用機(jī)制。方法 以D-半乳糖衰老模型小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以其體重、免疫器官重量、肝腦丙二醛(MDA)和脂褐素(LF)的含量，全血谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-PＸ）、紅細(xì)胞過氧化氫酶(CAT)和腦中超氧化物歧化酶(SOD)的活力，腦中谷氨酸水平為指標(biāo)，全面考察銀杏黃酮的抗衰老作用。結(jié)果 銀杏黃酮(125、250、500mg/kg，ig)，能對(duì)抗連續(xù)6周給5%D-半乳糖0.25ml/10g所致小鼠腦組織中LPO、LF含量的升高，提高全血GSH-PＸ、紅細(xì)胞CAT和腦中SOD的活力，并對(duì)抗小鼠體重、脾臟及胸腺指數(shù)下降。結(jié)論 銀杏黃酮能有效地對(duì)抗D-半乳糖所致的小鼠多項(xiàng)衰老指標(biāo)的出現(xiàn)，促進(jìn)衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
【關(guān)鍵詞】 銀杏黃酮；D-半乳糖；衰老；小鼠；L-谷氨酸
【Abstract】 Objective By using the D-galactose-induced aging mice，the effects and mechanism of Ginkgo flavone on aging were investigated.Methods Ginkgo flavone were given to mice by ig and D-galactose were injected into mice for six weeks.Then，the ability of study of mice，the content of LPO，LF and the L-glutamate，the body weight，the index of thymus and spleen，the activities of superoxide dismutase(SOD)，catalase(CAT)and whole blood glutathione peroxidase(GSH-PＸ)were determined.Results To the D-galactose-induced aging mice，Ginkgo flavone(125，250，500mg·kg－１，ig)reduced the content of LPO，LF，L-glutamate in brain，inhibited the decrease of body weight and the weight of thymus and spleen，enhance the activities of SOD in brain，CAT in erythrocyte and whole blood GSH-PＸ.Conclusion Ginkgo flavone shows a remarkable anti-aging effect on the D-galactose-induced aging mice.
【Key words】 Ginkgo flavone； aging； D-galactose； mice； L-glutamate
銀杏黃酮(Ginkgo flavone)是從中草銀杏中提取分離的有效成分，及基礎(chǔ)研究［１，２］表明，銀杏黃酮對(duì)衰老和老年性癡呆有一定的治療作用，認(rèn)為作用機(jī)制可能是使衰老動(dòng)物和老年性癡呆人腦組織中M１受體上調(diào)。但衰老是個(gè)綜合過程，涉及機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)、不同結(jié)構(gòu)層次的多項(xiàng)指標(biāo)。目前銀杏黃酮對(duì)老化相關(guān)酶、老化代謝產(chǎn)物的影響報(bào)道尚少，特別是谷氨酸和衰老的關(guān)系是近幾年研究的熱點(diǎn)［３］。本文采用D-半乳糖衰老模型小鼠考察了Ginkgo flavone 對(duì)上述多項(xiàng)指標(biāo)的影響，同時(shí)測定動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的變化。
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1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠［合格證號(hào)：SCXK(魯)20030004］♂，體重18～22g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.2 藥品與試劑 銀杏黃酮(Ginkgo flavone)：沈陽藥科大學(xué)植化教研室提供。D-半乳糖：Sigma公司生產(chǎn)，上海生化試劑公司分裝，批號(hào)：980927。硫代巴比妥酸(Thibarbituric acid，TBA)：上海制劑二廠，批號(hào)：920620。芐胺(Benzyl amine)：新華活性材料研究所，批號(hào)：20000123。谷胱苷肽(GSH)：上海政翔醫(yī)用科技實(shí)業(yè)服務(wù)部化學(xué)試劑研究所，批號(hào)：990915。二硫硝基苯(dithionitobenzene；DTNB)：FLUKA產(chǎn)品，批號(hào)：980716。L-谷氨酸：上�？颠_(dá)氨基酸廠產(chǎn)品，批號(hào)：20000531。茚三酮：上海試劑三廠產(chǎn)品，批號(hào)：990325。GSH-PＸ、CAT、SOD測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)：20030225。
1.3 儀器 WFZ800-D2型紫外可見分光光度計(jì)，北京第二光學(xué)儀器廠；HITACHI650-60型熒光分光光度計(jì)，日本；電泳儀，DYY-Ⅲ型，北京六一儀器廠；721分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；910雙波長薄層掃描儀，日本島津公司。
2 方法
2.1 D-半乳糖衰老模型的建立［４］ 取健康♂小鼠75只，隨機(jī)分為正常組、模型組、給藥組。各給藥組ig Ginkgo flavone(125、250、500mg/kg)；正常組和模型組ig等體積的CMCNa；給藥同時(shí)模型組和各給藥組皮下注射5%D-半乳糖0.25ml/10g；正常組皮下注射等體積的生理鹽水；連續(xù)6周，最后1天灌胃和注射D-半乳糖2h后，進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，次日測定記憶成績。然后處死，測定各項(xiàng)衰老指標(biāo)。
2.2 D-半乳糖衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測定(跳臺(tái)法)［５］ 將動(dòng)物放入跳臺(tái)箱內(nèi)適應(yīng)3min，然后立即通36V交流電。動(dòng)物受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激，如此訓(xùn)練5min。24h后重做測驗(yàn)，此即記憶保持測驗(yàn)。記錄小鼠第1次跳下平臺(tái)的潛伏期和5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)。
2.3 D-半乳糖衰老模型小鼠腦組織MDA、LF含量測定［４］小鼠斷頭處死，立即取腦，用硫代巴比妥酸(TBA)法測定組織丙二醛(MDA)的含量；用熒光法測定腦組織中LF的含量。
2.4 D-半乳糖衰老模型小鼠全血GSH-PＸ、紅細(xì)胞CAT和腦中SOD活力的測定 小鼠末次給藥后第2天眼眶取血，斷頭處死取全腦，分別按試劑盒說明測定GSH-PＸ、CAT和SOD。
2.5 小鼠腦組織中谷氨酸含量的測定［６］ 小鼠斷頭處死，立即取全腦適量，用0.61mol/L的三氯乙酸制作10%的勻漿，取上清液用石油醚-正丁醇洗后，點(diǎn)樣，電泳，茚三酮顯色后用雙波長薄層掃描儀測定全腦谷氨酸的含量。
2.6 學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)采用x±s表示，組間比較采用t。
3 結(jié)果
3.1 銀杏黃酮對(duì)衰老模型小鼠體重及免疫器官重量的影響 與正常組比較，衰老模型小鼠體重及胸腺和脾臟指數(shù)降低，而銀杏黃酮(125、250、500mg/kg)可顯著抑制體重、胸腺和脾臟指數(shù)的降低，見表1。
Tab 1 The effect of Ginkgo flavone on the index of body weight，thymus and spleen of D-galactose-induced seniled mice （x±s，n=15）
注：＃＃P＜0.01，compared with control group；**P＜0.01，*P＜0.05，compared with model group
3.2 銀杏黃酮對(duì)衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠記憶明顯衰退，表現(xiàn)為錯(cuò)誤次數(shù)增加，潛伏期縮短(均P＜0.01)。與模型組比較，銀杏黃酮(125，250，500mg/kg)可使小鼠錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，潛伏期明顯延長，見表2。
Tab 2 The effect of Ginkgo flavone on the eeficit of learning and memory induced by D-galactose on mice in step-down tese (x±s，n=15)
注：＃＃P＜0.01，compared with normal group；*P＜0.05，**P＜0.01，compared with model group
3.3 銀杏黃酮對(duì)D-半乳糖致小鼠衰老模型腦內(nèi)LPO、LF、含量的影響 與正常組比較，衰老模型小鼠腦組織中LPO、LF、含量增高，而銀杏黃酮(125、250、500mg/kg)可顯著抑制LPO、LF含量的增高，見表3。
Tab 3 Effect of Ginkgo flavone on the content of LPO and LF on D-galactose-induced seniled mice (x±s，n=15)
注：＃＃P＜0.01 compared with control group；*P＜0.05，**P＜0.01，compared with D-galactose group
3.4 銀杏黃酮對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠全血GSH-PＸ、紅細(xì)胞CAT和腦中SOD活力的影響 與正常組比較，衰老模型小鼠全血GSH-PＸ、紅細(xì)胞CAT和腦中SOD活力明顯降低，而銀杏黃酮(125、250、500mg/kg)可顯著抑制3種酶活力的降低，見表4。
Tab 4 Effect of Ginkgo flavone on the activity of SOD of brain，CAT of erythrocyte and GSH-PX of blood in D-galactose-induced seniled mice. (x±s，n=15)
注：＃＃P＜0.01，＃P＜0.05，compared with control group；*P＜0.05，compared with D-galactose group
3.5 銀杏黃酮對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠全腦谷氨酸含量的影響
與正常組比較，衰老模型小鼠全腦谷氨酸含量增加，而銀杏黃酮(125、250、500mg/kg)可顯著抑制谷氨酸含量的增加，見表5。
Tab 5 Effect of Ginkgo flavone on the content of L-glutamate of brain，in D-galactose-induced
注：＃P＜0.05，compared with control group；*P＜0.05，compared with D-galactose group
4 討論
D-半乳糖亞急性衰老模型是利用給小鼠連續(xù)皮下注射大劑量D-半乳糖，造成動(dòng)物糖代謝紊亂而建立的。D-半乳糖在半乳糖氧化酶催化下，可產(chǎn)生超氧陰離子等氧自由基。氧自由基具有高度活性，可以攻擊膜磷脂中的不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、酶及胞核內(nèi)的DNA等；自由基還可使脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用而形成過氧化脂質(zhì)(LPO)，LPO隨蛋白沉淀后在酸性條件下生成MDA，MDA是活潑的交聯(lián)劑，可迅速與磷脂酰乙醇胺生成熒光色素，然后與蛋白質(zhì)、肽類、脂類結(jié)合形成板層狀脂褐質(zhì)(LF)。用D-半乳糖連續(xù)注射，小鼠可產(chǎn)生多項(xiàng)生化指標(biāo)的變化，如腦組織MDA、LF含量的升高；腦中SOD、血中GSH-PＸ、紅細(xì)胞中CAT活力的降低，這些變化和自然衰老的變化相一致，說明D-半乳糖可引起細(xì)胞和機(jī)體的衰老［７，８］。SOD、GSH-PＸ、CAT活性間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力；而MDA、LF水平高低間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。
谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明，自然衰老動(dòng)物腦中谷氨酸含量增加，此物質(zhì)持續(xù)激活N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate；NMDA)受體，使細(xì)胞外Ca２＋內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca２＋超載，產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷；如腦組織中一些特殊神經(jīng)元被破壞，其功能喪失可加速衰老過程，最終導(dǎo)致多種衰老體征的出現(xiàn)。因此，Poeggeler［３］認(rèn)為谷氨酸的增多與衰老有密切聯(lián)系，大致可概括：谷氨酸-自由基-衰老。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，模型小鼠腦中谷氨酸含量增加，進(jìn)一步證明D-半乳糖模型的實(shí)用性和全面性，腦內(nèi)谷氨酸含量可作為一種新的衰老指標(biāo)，用于抗衰老物的研究。
本研究表明：銀杏黃酮可以有效對(duì)抗D-半乳糖所致的小鼠亞急性衰老和學(xué)習(xí)記憶能力的降低，具有抗衰老作用。其抗衰老的機(jī)制可能是通過提高機(jī)體SOD、GSH-PＸ、CAT等抗氧化酶活力，減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)-谷氨酸的含量，從而對(duì)抗自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，降低LPO、LF等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生而有效地對(duì)抗D-半乳糖所致的小鼠衰老體征的出現(xiàn)和學(xué)習(xí)記憶能力的下降。
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