矽肺模型大鼠肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP

          作者：王海濤，劉昊，顏京霞，田艷霞，江小華，高俊玲

【關(guān)鍵詞】  肺間質(zhì)纖維化

    Expression of matrix metalloproteinase2 and 9 in pulmonary fibroblasts of silicotic fibrosis rat model

　　【Abstract】 AIM: To study the expression of MMP2 and MMP9 in fibroblasts of rat silicotic fibrosis model and its significance. METHODS:  Fifty pathogenfree Wistar rats were randomly divided into experimental group and control group. Experimental group was instillated with SiO2, while control group with normal saline. Pulmonary interstitial fibroblasts were isolated on day 1, 3, 7, 14 and 28 after SiO2 exposure. The protein and mRNA expression of MMP2 was evaluated by immunocytochemistry and RTPCR. RESULTS:  ①The MMP2 protein expression in fibroblasts increased on day 1 after SiO2 exposure and reached 3.887 times（t=23.667，P<0.001） that of control group on day 7. The expression of MMP9 protein also increased on day 1 after SiO2 exposure and reached 3.103 times that of control group（t=11.399, P<0.001）on day 7. ② The mRNA expression of MMP2 and MMP9 was enhanced in fibroblasts at 24 h after SiO2 instillation. CONCLUSION:  The expression of MMP2 and MMP9 in fibroblasts is upregulated in silicotic fibrosis model.

　　【Keywords】 matrix metalloproteinase; fibroblast cells; pulmonary fibrosis; silicotic fibrosis

　　【摘要】 目的:探討肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2和MMP9在SiO2致肺纖維化中的表達(dá)及意義. 方法: 清潔級(jí)Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組氣管內(nèi)注射SiO2懸液，對(duì)照組代以等劑量生理鹽水. 注射后1，3，7，14和28 d分離和提取肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）方法，觀察其MMP2，MMP9蛋白及其mRNA的動(dòng)態(tài)變化.  結(jié)果:①SiO2作用后1 d成纖維細(xì)胞MMP2表達(dá)增高，7 d達(dá)高峰，為對(duì)照組的3.887倍（t=23.667，P<0.001）；MMP9在SiO2作用后1 d表達(dá)增高，7 d達(dá)對(duì)照組的3.103倍（t=11.399，P<0.001）；②MMP2 mRNA和MMP9 mRNA的轉(zhuǎn)錄從SiO2作用后1 d就開(kāi)始升高. 結(jié)論:受SiO2刺激后，肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞上調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)，損傷肺泡基底膜，啟動(dòng)肺纖維化的發(fā)生.

　　【關(guān)鍵詞】 基質(zhì)金屬蛋白酶；肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞；肺間質(zhì)纖維化；矽肺
　
　　0引言

　　基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物（matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, MMP/TIMP）是肺纖維化效應(yīng)細(xì)胞分泌的生物活性分子，在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的合成和降解中具有重要意義. 在MMP家族中，MMP2和MMP9的特異性底物主要是Ⅳ型膠原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分. 肺泡上皮細(xì)胞和基底膜的損傷是肺間質(zhì)纖維化過(guò)程的關(guān)鍵事件［1］. 我們?cè)赟iO2所致肺纖維化形成過(guò)程中的不同階段分離肺成纖維細(xì)胞（lung fibroblast,LFb），應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）對(duì)MMP2和MMP9蛋白及其mRNA進(jìn)行探討如下.

　　1和方法

　　1．1材料

　　健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180±40）g，由華北煤炭院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. SiO2粉塵（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞衛(wèi)所）；小鼠抗波形蛋白（vimentin） mAb及免疫組化染色SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；羊抗MMP2和羊抗MMP9多克隆抗體（Santa Cruz產(chǎn)品）；免疫組化SP試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）；Trizol試劑盒（Gibco公司產(chǎn)品）；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（Takara公司產(chǎn)品）；PCR擴(kuò)增試劑盒和DNA梯度Marker（Sangon公司）；引物由Sangon公司合成，PAGE純化. MMP2引物序列為5′CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG3′（sense），5′CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT3′（antisense），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為303 bp. MMP9引物序列為5′AAA TGT GGG TGT ACA CAG GC3′ （sense），5′TTC ACC CGG TTG TGG AAA CT3′（antisense），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為303 bp. 內(nèi)參照采用GAPDH，引物序列為5′CTT CTG AGT GGC AGT GAT GG3′ （sense），5′TGG CAC AGT CAA GGC TGA GA3′（antisense），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為389 bp.

　　1．2方法

　　大鼠50只，隨機(jī)等分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組. 實(shí)驗(yàn)組大鼠乙醚麻醉后，采用經(jīng)氣管染SiO2粉塵法復(fù)制矽肺模型［2］. SiO2粉塵懸液50 g/L，生理鹽水配制，每只大鼠1 mL. 對(duì)照組在相同條件下氣管內(nèi)注入生理鹽水1 mL. 染塵后1，3，7，14，28 d分別處死實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各5只，無(wú)菌操作取肺. 采用酶消化法結(jié)合組織塊貼壁培養(yǎng)法分離和培養(yǎng)細(xì)胞. 用SABC法檢測(cè)細(xì)胞的波形蛋白（vimentin）的表達(dá)，以鑒定分離培養(yǎng)的細(xì)胞為肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞.

　　1．2．1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MMP2和MMP9將第4代LFb接種于載玻片上，貼壁后，血清饑餓使其同步化，按照SP試劑盒說(shuō)明，作細(xì)胞爬片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色. 羊抗鼠MMP2一抗和羊抗鼠MMP9一抗1∶150稀釋. DAB顯色. PBS代替一抗作陰性對(duì)照. 染色結(jié)果經(jīng)Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北航）作圖像分析，胞質(zhì)中的棕褐色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)強(qiáng)度用積分吸光度（A）表示.

　　1．2．2RTPCR檢測(cè)MMP2和MMP9 mRNA按照Trizol試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA. 逆轉(zhuǎn)錄步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)條件42℃ 15 min，95℃ 2 min；PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟參照說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)條件94℃，45 s；58℃，45 s；72℃，80 s；30個(gè)循環(huán). 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳. 電泳條帶采用凝膠成像系統(tǒng)做積分吸光度（A值）測(cè)定，以實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MMP2, MMP9與GAPDH的A比值的表示MMP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量.

　　學(xué)處理：  數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行組間t，方差不齊時(shí)用t′檢驗(yàn).

　　2結(jié)果

　　2．1MMP2和MMP9的表達(dá)矽肺模型組大鼠LFb MMP2和MMP9表達(dá)比對(duì)照組明顯增強(qiáng)，7 d為表達(dá)高峰(Tab 1, Fig 1).表1肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2, MMP9蛋白及mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化（略）

　　2．2MMP2和MMP9 mRNA的變化模型組LFb MMP2和MMP9 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較明顯增高(Tab 1).

　　3討論

　　長(zhǎng)期吸入SiO2粉塵引起的矽肺，其主要病理改變是矽結(jié)節(jié)形成和間質(zhì)纖維化, 但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明. 目前認(rèn)為,吸入SiO2粉塵后，肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分泌多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致肺泡炎的發(fā)生發(fā)展，最終引起進(jìn)行性肺間質(zhì)纖維化. 纖維化的發(fā)生是細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解不平衡的結(jié)果. 近年來(lái)，細(xì)胞外基質(zhì)降解系統(tǒng)尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子功能紊亂，在纖維化疾病中愈來(lái)愈受到重視. 研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶在細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重塑的病理生理發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵性作用. MMP2和MMP9的特異性底物是Ⅳ型膠原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分. 由致病因素引起的MMP2,MMP9高表達(dá)在破壞肺泡上皮細(xì)胞基底膜繼而纖維母細(xì)胞侵入肺泡腔引起肺纖維化中起作用［3］. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床均表明，在肺纖維化中有MMP2和MMP9的高表達(dá)［4］.

　　本結(jié)果顯示,注入SiO2粉塵后1 d MMP2蛋白表達(dá)即顯著升高，達(dá)到對(duì)照組的1.245倍（t=2.660，P<0.05），7 d達(dá)到高峰，為對(duì)照組的3.887倍（t=23.667，P<0.01），28 d仍顯著高于對(duì)照組（t=5.621，P<0.01）. 其mRNA表達(dá)亦明顯增高. MMP9及其mRNA表達(dá)和對(duì)照組比較在1，3，7 d顯著升高. 提示在肺間質(zhì)纖維化早中期，肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞是MMP2和MMP9來(lái)源之一. 肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞可能通過(guò)高表達(dá)MMP2和MMP9，啟動(dòng)了介于炎癥細(xì)胞之間、炎癥細(xì)胞與肺組織 結(jié)構(gòu)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間持續(xù)進(jìn)行性發(fā)展的“cross talking”［5］. 研究表明，在肺纖維化模型中肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞可以高表達(dá)MMP2，亦有學(xué)者對(duì)肺纖維化患者的肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，亦發(fā)現(xiàn)其具有顯著增高的MMP9表達(dá)［6］. 可見(jiàn)，肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞不單純是肺纖維化的效應(yīng)細(xì)胞. 注入SiO2粉塵后，肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞通過(guò)表達(dá)MMP2和MMP9，參與肺泡基底膜的損傷，從而參與啟動(dòng)肺纖維化.

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