天南星類中藥材的PAGE鑒別

　　摘要　應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)技術(shù)，對天南星類材進(jìn)行鑒別分析結(jié)果表明：三種天南星藥材樣品的PAGE圖譜完全不同，可作為天南星類中藥材鑒別的一種有效方法。

Abstract:

　　Polyacrylamide Gel electrophoresis ［PAGE］ was used to determine the traditional Chinese medicinal materials of three kinds Arsaema consangumeum Schott.Results Showed that their PAGE bands were always quite distinct,which can be used to assess their quatity and distinguish them from confusable varieties.

　　Key words:Arisaema consangumeum Schott.Arisaema heterophyllum bi.

　　pinellia peclatisecta Schott.PAGE identification.

　　天南星主要用于祛風(fēng)定驚，散結(jié)化痰。外用可治療瘡瘍腫毒、蛇蟲咬傷。近年來臨床上用于治療宮頸癌，有很好的療效。因天南星藥材親緣關(guān)系相近，性狀類別相似，用常規(guī)的性狀顯微鑒別方法很難鑒別分析。研究表明，天南星藥理作用的主要有效成分含有蛋白質(zhì)，故可應(yīng)用PAGE技術(shù)對其進(jìn)行鑒別［1］［2］�，F(xiàn)報(bào)道如下。

　　1　實(shí)驗(yàn)與儀器

　　天南星(Arisaema Consanguineum Schott)樣品Ⅰ、異葉天南星(Arisaema heterophyllum Bi)樣品Ⅱ、虎掌(掌葉半夏)(Pinellia peclatisecta Schott)樣品Ⅲ，以上樣品均為鮮品，由湖北學(xué)院藥學(xué)系鑒定教研室鑒定并提供。

　　DYY-Ⅲ4型雙穩(wěn)電泳儀、DYY-Ⅲ28型垂直板型電泳槽(北京六一儀器廠)。

　　2　試劑的配制與凝膠的制備

　　2.1　試劑配制

　　A：36.6g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，48ml，1mol/L的Hcl加水到1000ml;B：5.98Tris,48ml,1molHcl加水到100ml；C：30g丙烯酰胺(Acr)，0.8g甲叉雙丙烯酰胺(Bis)加水到100ml過濾后使用；D：10gAcr,2.5gBis加水到100ml過濾后使用；E：4mg核黃素加水到100ml；F：40%(W/V)的蔗糖溶液；G：0.56g的過硫酸銨加水到100ml(AP溶液)；H：6gTris,28.8g甘氨酸加水到1000ml，使用時稀釋10倍，此為電極緩沖液。

　　2.2　凝膠的制備及電泳槽的安裝［3］

　　2.2.1　本實(shí)驗(yàn)采用垂直板電泳槽　凝膠模子是由兩塊玻璃裝入一個用硅酮橡膠做成的夾套內(nèi)構(gòu)成，玻璃板厚2mm，兩玻璃板之間由夾套隔開厚約1.5mm，膠就在這兩板之間的膠室內(nèi)聚合成平板膠。安裝電泳槽時，玻璃板先用熱的去污劑刷洗或洗液浸泡，然后用熱水沖洗，再用蒸餾水沖洗，直立干燥。勿用手指接觸洗凈的玻璃板面，將兩塊玻璃板裝入橡膠夾套內(nèi)，然后垂直地裝入兩個半槽之間，用螺絲將兩個半槽固定在一起，注意在上螺絲時，要按照一定的順序一個個的逐步檸緊，均勻用力。電泳槽裝好后將熔化的1.5 %的瓊脂注入背面槽內(nèi)的小池中，使在膠池的下部凝結(jié)成約0.5cm厚的瓊脂層，備用。

　　02.2.2　分離膠的制備

　　將試劑A∶C∶水∶G按1∶2∶1∶4的比例(V/V)混合，然后按每ml膠液0.6μl的比例加入加速劑四甲基乙二胺(TEMED)、混合后立即裝入槽中，膠液加到距玻璃板頂部3cm處(注意排除可能存在的氣泡)，上面再加約4mm厚的水層以隔絕空氣并使膠面平坦。

　　2.2.3　濃縮膠的制備

　　將試劑B∶D∶E∶F按1∶2∶1∶4的比例(V/V)混合，然后按每ml膠液1.5μl的比例加入TEMED。然后再加到吸去表面水層的分離膠上部，高約3cm，并放好樣品槽模板(俗稱梳子)，光照聚合，聚合約需30～40分鐘，膠聚合后，小心取出“梳子”，加入上槽電極緩沖液備用。

　　3　樣品液的制備

　　精確稱取樣品Ⅰ2g加0.9%的生理鹽水4ml研磨成漿后置離心管中離心15分鐘(3000rpm/min)，取上清液2ml加入4ml丙酮沉淀離心，傾出上清液，將沉淀加2ml蒸餾水溶解后裝入半透膜袋中透析48小時(其間更換蒸餾水?dāng)?shù)次)，即得樣品液Ⅰ，置冰箱中備用。用同樣的方法處理Ⅱ、Ⅲ號樣品。

　　4　點(diǎn)樣

　　用微量注射器分別吸�、瘛ⅱ�、Ⅲ號樣品液各25μl注入到樣品槽內(nèi)的電極緩沖液與濃縮膠之間界面上。并在上槽緩沖液中加入1～3滴溴酚藍(lán)指示劑示蹤。

　　5　電泳

　　加樣后，向兩槽內(nèi)注入電極緩沖液，接通電源立即電泳。前后兩槽分別接入電源的負(fù)、正極上，開始電流調(diào)節(jié)為9mA,當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，加大電流至12mA，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠未端約1cm時，停止電泳。

　　6　染色

　　取出膠板后，放入0.2%的考馬斯亮藍(lán)(R250)染色液中，在36°C下染色1小時，用蒸餾水沖去凝膠表面附著的染料，再用含20%甲醇和7%醋酸的脫色液脫色，經(jīng)常更換脫色液，直至背景清晰為止。

　　7　結(jié)果與討論

　　PAGE技術(shù)操作簡便，重現(xiàn)性良好，凝膠本身有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，在本實(shí)驗(yàn)中我們曾做過數(shù)次重復(fù)，所得電泳圖譜穩(wěn)定可靠，此外，采用垂直板型PAGE，操作及制膠板方便，并可在一塊膠上(120mm×100mm×1.5mm)同時進(jìn)行十幾種樣品的PAGE分析，且樣品和試劑用量少，符合多快好省的要求，特別適用于含有蛋白質(zhì)成分的各類中藥材(如：果實(shí)種子類、根皮類及動物類中藥)的質(zhì)量分析及真?zhèn)舞b別。

 

 

 

　　參考文獻(xiàn)

　　1　陳振江.高效電泳技術(shù)及其在藥劑學(xué)中的應(yīng)用中草藥，1994，16(9)：52

　　2　陳振江.中藥青葙子、土鱉蟲的等電聚焦電泳的研究.中草藥，1996，27(10)：593

　　3　袁曉華等.植物生理生化實(shí)驗(yàn).北京：高等出版社，1983.64

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