【關(guān)鍵詞】  ,腎移植

    Effect of simvastatin on expression of RANTES and its receptor CCR5 mRNA in renal transplant recipients with hyperlipidemia

　　【Abstract】 AIM: To study whether hyperlipidemia after renal transplantation is related to the expression of RANTES (regulated on activation normal Tcell expressed and secreted) and its receptor CCR5 (chemokine receptor 5) mRNA in peripheral monocyte cells (PMCs) and to explore its therapy. METHODS:  Renal recipients were divided into normal lipidemia group (n=30) and hyperlipidemia group (n=30) according to the serum lipid level 6-8 months after transplantation. The patients in the hyperlipidemia group were treated with simvastatin for 1.5 months (1.5month treatment group) or 3 months (3month treatment group). The control group consisted of 30 healthy subjects. Serum total cholesterol (TC), triglyceride (TG), lowdensity lipoprotein (LDL), highdensity lipoprotein (HDL) were measured and RTPCR was used to detect the expression of RANTES and CCR5 mRNA in PMCs. RESULTS:  The renal function of all the patients was normal. TC, TG, LDL and expression of RANTES and CCR5 mRNA in the normal lipidemia group were lower than those in the hyperlipidemia group, but higher than those in control group (P<0.05), and those in 3month treatment group were significantly lower than those in 1.5month treatment group (P<0.05). CONCLUSION:  The expression of RANTES and CCR5 mRNA is involved in the earlystage chronic injury of kidney allografts. Hyperlipidemia can strengthen the increased expression of RANTES and CCR5 mRNA. Simvastatin can reduce the expression of RANTES and CCR5 mRNA in the kidney transplant recipients with hyperlipidemia.

　　【Keywords】 kidney transplantation；hyperlipidemia；RANTES；RTPCR；simvastatin

　　【摘要】 目的: 探討腎移植術(shù)后高脂血癥患者外周血RANTES (regulated on activation normal Tcell expressed and secreted)及其受體CCR5(chemokine receptor 5) mRNA表達(dá)及治療. 方法: 根據(jù)患者腎移植術(shù)后6~8 mo的血脂水平分血脂正常組（n=30）和血脂增高組（n=30），血脂增高組又根據(jù)辛伐他汀治療時(shí)間分1.5 mo治療組（n=30）和3 mo治療組（n=30），并設(shè)正常對照組（n=30），利用RTPCR檢測各組患者外周血RANTES和CCR5 mRNA表達(dá)水平.  結(jié)果: 各組腎功能正常，膽固醇酯，三酰甘油，低密度脂蛋白水平均按對照組，血脂正常組，血脂增高組順序遞增(P<0.05)，3 mo治療組較1.5 mo治療組有顯著降低(P<0.05)；RANTES及其受體CCR5 mRNA表達(dá)水平按對照組，血脂正常組，血脂增高組順序遞增，1.5 mo治療組和3 mo治療組均較血脂增高組有顯著降低（P<0.05)，而3 mo治療組又明顯低于1.5 mo治療組(P<0.05). 結(jié)論： RANTES及其受體CCR5 mRNA表達(dá)可能在移植腎慢性損傷早期起作用；高脂血癥能加重已增高表達(dá)，辛伐他汀治療可降低表達(dá).

　　【關(guān)鍵詞】 腎移植；高脂血癥；RANTES；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；辛伐他汀

　　0引言

　　腎移植后約半數(shù)以上患者發(fā)生脂代謝紊亂，主要表現(xiàn)為膽固醇（cholesterol, CH），三酰甘油(triglyceride, TG)，低密度脂蛋白（LDL）和極低密度脂蛋白（VLDL）升高，高密度脂蛋白（HDL）降低［1］. 高脂血癥不但是移植后心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因子，也是移植腎慢性排斥發(fā)生的重要原因［2］. 趨化因子（chemokine）受體CCR5（chemokine receptor 5）是RANTES（regulated on activation normal Tcell expressed and secreted）的主要受體. 我們應(yīng)用RTPCR方法檢測腎移植術(shù)后高脂血癥患者外周血中RANTES及其受體CCR5 mRNA水平，并觀察辛伐他汀降脂治療對其影響如下.

　　1和方法

　　1.1材料

　　腎移植患者60例，原發(fā)病為慢性腎小球腎炎，移植前血清總膽固醇（total cholesterol,TC），TG水平正常；術(shù)后6~8 mo：① 血脂正常組：TC<5.85 mmol/L或(和)TG<1.70 mmol/L，30（男16，女14）例，年齡（40±10）歲；②血脂增高組：TC>5.85 mmol/L或(和)TG>1.70 mmol/L，30（男17，女13）例，年齡（41±9）歲；血脂增高組予辛伐他汀治療1.5 mo和3 mo時(shí)收集標(biāo)本，即為1.5 mo治療組和3 mo治療組. 對照組為健康體檢者30(男15，女15)例，年齡（40±9）歲. 抽取空腹靜脈血，分成2份，一份檢測血脂水平，一份分離外周單個(gè)核細(xì)胞(peripheral mononuclear cell, PMNC) 抽提總RNA. 抽血前1 mo內(nèi)無感染性疾病史. 淋巴細(xì)胞分離液Ficol購自上海生物制品所；Trizol，氯仿，異丙醇，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑，0.1 mol/L DTT，隨機(jī)引物，dNTP，購自Gibco公司；Taq DNA聚合酶，2.5 mmol/L MgCl2，瓊脂糖，購自Promega公司.

　　1.2方法

　　血標(biāo)本抽取PMNC轉(zhuǎn)移至無Rnase的Ependoff管中，加Trizol 1 mL，劇烈震蕩，室溫放置5 min，加氯仿0.2 mL，2000 g 4℃離心15 min. 轉(zhuǎn)移上清液至另一Ependoff管中，加異丙醇0.5 mL，室溫靜置10 min，12 000 g, 4℃離心15 min，棄去上清液，加750 mL/L乙醇1 mL，12 000 g, 4℃離心10 min；棄去上清液，室溫干燥5~10 min，加EDPC水20 μL混勻，取1 μL以純水稀釋100倍，紫外分光光度計(jì)測A值與RNA濃度. RTPCR引物：Nucleotide上查找RANTES和CCR5基因序列，Primer3軟件設(shè)計(jì)，Takara公司合成. 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度如下：RANTES上游引物 AGCTACTCGGGAGGCTAAGG，下游引物GAGGCATGCTGACTTCCTTC，產(chǎn)物長度276 bp；CCR5上游引物TAGTCATCTTGGGGCTGGTC，下游引物TGTAGGGAGCCCAGAAGAGA，產(chǎn)物長度168 bp；βactin上游引物TGGCACACCTTCTACAATGAGCT，下游引物CGTCATACTCCTTGCTCCACATCTGC，產(chǎn)物長度838 bp. 取RNA 1 μg,隨機(jī)引物1 μL,dNTP 1 μL，加DEPC水至11.5 μL，70℃預(yù)變性5 min；加5×Buffer 5 μL, 0.1 mol/L DTT 2 μL,RNA酶抑制劑0.5 μL,MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，37℃ 1 h，95℃ 5 min，加150 μL純水稀釋，取1 μL紫外分光光度計(jì)測A值與cDNA濃度. PCR反應(yīng)：10×Buffer 5 μL,2.5 mmol/L MgCl2 4 μL,dNTP 200 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U、相應(yīng)上下游引物各1 μL，加雙蒸水至50 μL，95℃預(yù)變性3 min，進(jìn)入循環(huán)：94℃30 s，57℃ 45 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循，72℃保溫10 min.  PCR產(chǎn)物10 μL,βactin產(chǎn)物1.5 μL, 2 kb DNA Marker 5 μL，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳30 min，紫外光下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Synegene tool軟件進(jìn)行圖像分析，測產(chǎn)物條帶的光密度，計(jì)算目標(biāo)產(chǎn)物與βactin的比值.

　　學(xué)處理：組間比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析，其余采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析,如方差不齊采用非參數(shù)KruskalWallis，并進(jìn)行各組間的兩兩比較.