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苯唑西林對金葡球菌ATCC25923青霉素結(jié)合蛋白親和力研究
論文關(guān)鍵詞 青霉素結(jié)合蛋白苯唑西林 親和力
論文摘要 利用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳、熒光放射自顯影術(shù)及競爭分析法檢測苯唑西林對金葡球菌ATCC25923青霉素結(jié)合蛋白的親和力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)金葡球菌有5條青霉素結(jié)合蛋白,即PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5,分子量范圍41~87kD。苯唑西林主要與金葡球菌ATCC25923的PBP1和PBP2親和力強,尤其是與PBP2親和力很強。由此說明金葡球菌的PBP1和PBP2是苯唑西林的主要作用靶位。
青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-bindingproteins,PBPs)是存在于細菌細胞內(nèi)膜上一群能同青霉素和其他β-內(nèi)酰胺類抗生素螯合的細菌蛋白質(zhì),即是抗生素作用的靶位點,抗生素與這些靶位點結(jié)合后,干擾細菌細胞壁肽聚糖合成而導(dǎo)致細菌細胞溶解死亡。苯唑西林(oxacillin)對金葡球菌具有強大的抗菌作用,對其作用機制的研究,國內(nèi)未見報道。本文應(yīng)用微生物生化研究方法,從金葡球菌標準株ATCC25923中提取細菌內(nèi)膜蛋白,采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)、熒光放射自顯影術(shù)及競爭分析法,研究了苯唑西林與金葡球菌標準株ATCC25923細胞內(nèi)膜青霉素結(jié)合蛋白的親和力,探討苯唑西林殺菌作用的分子學(xué)基礎(chǔ)。
1 和方法
1.1 品及試劑
苯唑西林為國家暫行標準品,910u/mg;溶葡萄球菌素(lysostaphin)為Sigma公司產(chǎn)品; -青霉素G鉀,比活性Bq/mmol,英國Amersham同位素公司產(chǎn)品;十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺和Triton X-100, 為Sigma公司產(chǎn)品;PPO(2,5-diphenyl-oxa-zol),瑞士Fluka公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO),重慶化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;X光片為美國Kodak公司產(chǎn)品。
1.2 實驗儀器
超聲粉碎機(Virsonic 300型),美國Vir-tis公司產(chǎn)品;超速低溫離心機Beckman L8-60,美國Beckman公司產(chǎn)品;直立式電泳儀,北京六一儀器廠生產(chǎn);凝膠吸干器(gel slabdryer),英國Bio-Rad公司產(chǎn)品。
1.3 菌株
金葡球菌標準株ATCC25923,獲自中國科學(xué)院菌種保存中心。
1.4 研究方法
1.4.1 增菌
將金葡球菌接種于M-H肉湯(pH7.2)25ml中,37℃恒溫振蕩(速度150~200r/min)孵育16h,再轉(zhuǎn)移至250ml新鮮預(yù)熱的M-H肉湯中繼續(xù)振蕩4h。于10℃,8000×g離心10min收集菌體,用50mmol/L PBS(pH7.0)洗滌1次,稱濕菌量可達1~2g。
1.4.2 細菌細胞內(nèi)膜蛋白質(zhì)的制備
參照文獻[1]并作改進。將濕菌懸于2倍體積的50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5,含10mmol/L MgCl2、0.14mol/Lβ-巰基乙醇、0.5mg/L DNaseⅠ、300mg/L溶菌酶、25mg/L溶葡萄球菌素),37℃,孵育30~60min,然后在冰浴中進行超聲粉碎(60s破碎+60s間隔,強度14kHz,共6次),在顯微鏡下觀察細胞破裂情況。7000×g,4℃,離心10min去除未破碎細胞。上清液于100000×g,4℃,離心50min使細胞膜沉淀,沉淀物用400~500μl PBS(pH7.0,含1mol/L NaCl,2% Triton X-100,1mmol/Lβ-巰基乙醇)混勻,放0℃30min,于45000×g,4℃,離心35min,上清液(含細菌內(nèi)膜蛋白)采用Lowry法[2]測定其蛋白質(zhì)含量,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度為10g/L,分裝后放-70℃?zhèn)溆谩?/P>
1.4.3 苯唑西林與-青霉素G競爭性結(jié)合
參照文獻[3]并有改進。在一系列新鮮配制的苯唑西林溶液(0,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,32,128mg/L)10μl/管中加入膜蛋白20μl(200μg蛋白質(zhì))混勻,37℃,孵育10min,然后加入10μl(3.7×104Bq)14C-青霉素G鉀繼續(xù)育10min,最后加入10μl終止緩沖液(3.8%Tris,10%SDS,0.005%溴酚藍,50%甘油(V/V),25%β-巰基乙醇(V/V),pH7.0)終止反應(yīng),煮沸5min,待冷卻后作短暫離心,經(jīng)電泳分離蛋白質(zhì)。
1.4.4 SDS—PAGE
使用不連續(xù)的垂直電泳法,10%分離膠,5%濃縮膠,每孔加樣50μl,電壓75~120V,電流20~30mA,電泳4~6h(即溴酚藍移至距底部約1cm處),凝膠用0.25%考馬斯亮藍R-250染色4h以上,然后用90%甲醇與10%冰乙酸脫色數(shù)次。
1.4.5 熒光放射自顯影(Fluorography)
參照文獻[4],將脫色的凝膠浸泡于相當于其20倍體積的二甲基亞砜(DMSO)中,1h后更換新鮮的DMSO再浸泡1h。然后凝膠浸泡于相當其5倍體積的22.2% PPO/DMSO中3h,繼之置凝膠于蒸餾水中浸泡3h及含10%冰乙酸、1%甘油溶液中浸泡45 min。經(jīng)凝膠干燥器進行真空干燥。將X光片進行預(yù)曝光,其目的是校正樣品的放射量與X光片呈現(xiàn)影象的非線性關(guān)系。預(yù)曝光劑量X線電壓40kV,電流50mA,距光源距離50 cm,曝光時間0.02s,即使X光片影象強度增加0.25左右。干燥的凝膠與經(jīng)預(yù)曝光的X光片緊密接觸,-50℃低溫下曝光50~60d。曝光后的X光片在Kodak X光沖洗機中進行顯影、定影處理。
1.4.6 最低抑菌濃度(MIC)
采用試管二倍稀釋法,37℃,孵育16~18h后觀察結(jié)果,以肉眼觀察無細菌生長的最低濃度為MIC。
[1]
2 結(jié)果
2.1 苯唑西林對金葡球菌ATCC25923的MIC為0.25mg/L。
2.2 苯唑西林對金葡球菌ATCC25923青霉素結(jié)合蛋白的親和力見Fig.1。從圖中可知,金葡球菌標準株內(nèi)膜蛋白質(zhì)經(jīng)熒光放射自顯影后可見5條蛋白質(zhì)條帶(即5種青霉素結(jié)合蛋白PBP1~PBP5),分子量分別約為87、80、75、70和41kD,與國外文獻[5]報道一致。X光片上自顯影象強度反應(yīng)了抗生素與青霉素結(jié)合蛋白的親和力,影象強度越強(即蛋白質(zhì)條帶黑度越深,親和力越弱,反之,親和力越強。從圖上可見,苯唑西林濃度從0~128mg/L遞增時, PBP1和PBP2尤以PBP2影象強度逐漸減弱,即與抗生素親和力逐漸增加。PBP4在高濃度苯唑西林存在時影象強度減弱。PBP3和PBP5影象強度變化不大。說明金葡球菌PBP1、PBP2尤以PBP2是苯唑西林的主要作用靶位,即是苯唑西林的致死靶位。
Fig.1 Competition of oxacillin for PBPsofS.aureusATCC25923a~k:oxacillin concentrations 0,0.06,0.125, 0.25, 0.5, 1,2,4, 8,32,128mg/L respectively
3 討論
早在20世紀40年代已在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面對青霉素作用機制進行了初步探索,證明青霉素特異地干擾細菌細胞壁肽聚糖的生物合成。1965年,Wise和Park[6]對經(jīng)青霉素處理的金葡球菌進行了細致的生化研究,提供了青霉素抑制細菌細胞壁合成過程中交聯(lián)反應(yīng)的直接證據(jù),提出了青霉素作用機制經(jīng)典學(xué)說。70年代Spratt等[1]將電泳技術(shù)與熒光放射自顯影術(shù)相結(jié)合,建立了青霉素結(jié)合蛋白的研究方法。由于青霉素G與所有的青霉素結(jié)合蛋白都具有良好的結(jié)合,所以目前采用其標記物對PBPs從分子水平上進行探討。
β-內(nèi)酰胺類抗生素首先同細胞膜上的PBPs結(jié)合,這些PBPs具有酶活性,參與細菌細胞壁肽聚糖的合成。肽聚糖主要負責(zé)維持細菌細胞壁的完整性,β-內(nèi)酰胺類抗生素與PBPs結(jié)合干擾了PBPs正常的酶功能,使細胞壁正常合成阻斷。不同的β-內(nèi)酰胺類抗生素與不同的PBPs結(jié)合,結(jié)合后或引起細菌自溶,或形成球形體,或成絲狀細胞,最終細菌分裂停止而死亡。本研究表明,敏感的金葡球菌有5種PBPs,2種必需的PBPs(PBP1,PBP2)與苯唑西林具有強大的親和力。國外對金葡球菌的PBPs已進行了多方面研究[7,8],金葡球菌的PBP1、PBP2、PBP3是抗生素的主要作用靶位,與β-內(nèi)酰胺類抗生素具有很高親和力。PBP1可能是原始肽糖轉(zhuǎn)肽酶(peptidoglycantranspetidase),PBP2是靜止期細胞具有轉(zhuǎn)肽酶功能,PBP3是一種與分隔有關(guān)的轉(zhuǎn)肽酶,PBP4是一種涉及到轉(zhuǎn)輔助肽糖交聯(lián)的DD-羧肽酶和轉(zhuǎn)肽酶。由于苯唑西林與金葡球菌的2種致死性的PBPs(PBP1,PBP2)具有很高的親和力,說明苯唑西林對敏感的金葡球菌
具有很強的殺菌作用。因此,在上對于非耐性金葡球菌感染仍可選用苯唑西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素治療。
參考文獻
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8 Mwyke A W, Ward J R, Hayes M Vet al. A rolein vivo for penicillin-binding protein 4 ofStaphy-lococcus aureus. Eur J Biochem,1981;119:389
[2]
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