青霉素結(jié)合蛋白研究進(jìn)展

時(shí)間：2023-03-01 08:50:02 藥學(xué)畢業(yè)論文我要投稿

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青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)是廣泛存在于細(xì)菌表面的一種膜蛋白，是β_內(nèi)酞胺類抗生素的主要作用靶位。不同細(xì)菌其種類及含量均不相同。但各種菌種的PBPs又有許多類似的結(jié)構(gòu)與功能，在細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖中發(fā)揮重要作用。PBPs結(jié)構(gòu)與數(shù)量的改變是產(chǎn)生細(xì)菌耐的一個(gè)重要機(jī)制�，F(xiàn)今，各類抗生素雖種類繁多，但在耐藥菌的治療中仍缺乏有效手段。因此近年來圍繞PBPs開展了大量的研究工作，試圖從分子結(jié)構(gòu)與基因水平認(rèn)識(shí)PBPs，探求細(xì)菌耐藥的機(jī)制，企圖獲得更有效的治療手段。

　　1 PBPs研究簡(jiǎn)史及基本概念

盡管上很早就開始應(yīng)用青霉素，但到20世紀(jì)50年代，人們才認(rèn)識(shí)到青霉素是通過干擾細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)而起作用的。60年代，細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)被闡明，為人們認(rèn)識(shí)青霉素作用機(jī)制及PBPs奠定了基礎(chǔ)。1972年Suginak . Blumberg和Stro minge:發(fā)現(xiàn)青霉素結(jié)合蛋白，用放射性同位素標(biāo)記的青霉素可以標(biāo)出細(xì)菌表面的PBPs，但后來的研究發(fā)現(xiàn)并非所有PBP均是青霉素作用的致命靶位。所有細(xì)菌都含有多種青霉素結(jié)合蛋白，不同菌屬其PBPs含量、種類各不相同，不同的抗生素通過與不同的PBP蛋白結(jié)合而產(chǎn)生不同的抗菌活性。因此，與不同PBP結(jié)合的抗生素可聯(lián)合應(yīng)用，往往產(chǎn)生協(xié)同作用。

每個(gè)菌種都有一套特異的PBPs，稱PBPs譜。在一種菌種中PBPs按分子量大小排序，分別稱PBPI,PBP2,PBP3......。PBPl為分子量最大的一種。不同菌屬PBPs的生理功能很相近，而且分子結(jié)構(gòu)上也有其相關(guān)及相似性。PBPs含量很少，僅占細(xì)胞膜蛋白總量的1%，不同PBP含量變化很大，如大腸桿菌中高分子的PBPI,PBP2和PBP3量很少，而低分子PBPS和PBP6卻占PBPs量的70%—90%。各種PBP與抗生素親和力相差亦很大。親和力大小一般用。表示; 指使-青霉素G結(jié)合減少50%時(shí)該抗生素濃度，其值越高，示藥物親和力越小。

研究PBPs的方法與技術(shù)不斷地發(fā)展。比如現(xiàn)已用分子生物學(xué)方法研究PBPs分子結(jié)構(gòu)，基因構(gòu)成與變異，通過基因重組研究PBPs功能等。但傳統(tǒng)的方法仍是研究的基本方法，比如用超聲技術(shù)粉碎細(xì)菌，離心分離胞膜，用Triton X-100從胞膜中分離PBP s ,用一青霉素G標(biāo)記PBPs，用膠體電泳分離PBPs等。

　　2各種青霉素結(jié)合蛋白研究進(jìn)展

PBPs在不同菌種中各不相同，但對(duì)其分子結(jié)構(gòu)，生理功能的研究發(fā)現(xiàn)每種菌種均有特異PBPs,PBPs的生理功能直接影響與其結(jié)合的抗生素的抗菌活性，這方面的研究已積累了大量的資料.但某些問題及研究結(jié)果的意義仍不十分清楚，為了研究者能迅速了解這方面研究進(jìn)展，以下以大腸桿菌和肺炎球菌為例說明研究近況。

對(duì)大腸桿菌PBPs的研究最早開展，也是研究最多的，比較具有代表性。大腸桿菌含6種PBP，依次為PBPI,PBP2,PBP3.PBP4,PBPS,PBP6。

大腸桿菌PBP1主要功能為維持細(xì)胞形態(tài),可分成PBP1a,PBPlbs兩部分。PBPlbs主要分布于細(xì)胞內(nèi)膜.亦有少部分分布于細(xì)胞外膜①。是細(xì)菌生長(zhǎng)的重要蛋白，與抗生素結(jié)合可致細(xì)菌快速溶解.最近研究表明，PBP1b是一種球蛋白，具有2個(gè)密切相關(guān)的酶活性區(qū)，一為轉(zhuǎn)肚酶活性區(qū)(轉(zhuǎn)肚反應(yīng)是細(xì)胞壁合成中的限速反應(yīng))，另一為轉(zhuǎn)糖酶活性區(qū)②。 PBPla具有PBPlbs替代酶的作用。缺乏PBPla的變異株能夠存活，說明PBPla為細(xì)菌生長(zhǎng)非必需蛋白.用僅有PBPla,PBPlbs基因或特異性分裂基因ftsA, ftsQ,pbpB, ftsZ變異的細(xì)菌株來研究PBPa與PBP1 bs的功能時(shí)發(fā)現(xiàn):PBPla不能獨(dú)立維持細(xì)胞完整性，需與PBP2,PBP3及ftsQ基因產(chǎn)物一起才能維持細(xì)菌存活.而PBPI bs顯然較PBPla有更強(qiáng)的生物合成功能，在缺乏PBP1a,PBP2,PBP3和f tsQ基因產(chǎn)物時(shí)變異株細(xì)菌仍能存活，在細(xì)菌分裂中，PBPlbs也起著相當(dāng)作用，與膚聚糖的合成有關(guān)③④。

PBP2能維持大腸桿菌的張力，使菌體保持桿棒狀。PBP2僅占PBPs的1%。美西林、克拉維酸和硫霉素與PBP2有高度親和力。與PBP2結(jié)合后，可使細(xì)菌變成園球體，終致溶解、死亡。有實(shí)驗(yàn)表明在缺乏PBP2基因的菌株中，如能使PPGPP大量表達(dá)及分裂蛋白ftsZ,ftsA, ftsQ大量表達(dá)，細(xì)菌仍能存活并分裂繁殖⑤

PBP3與細(xì)菌分裂有關(guān)。在DNA復(fù)制完成后PBP3被激活，并催化梭基膚酶反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)菌分裂必需的肚聚糖合成反應(yīng)。低濃度的頭抱菌素作用于PBP3使細(xì)菌成為絲狀體(細(xì)菌分裂受阻，菌體卻不斷延長(zhǎng))，但一般菌體并不溶解⑥。

大腸桿菌PBP4同時(shí)具有D , D-梭膚酶活性及D.D一內(nèi)膚酶活性⑦。缺乏PBP4的變異株能很好地存活，因此PBP4并不是β一內(nèi)酞胺類抗生素的主要作用靶位。對(duì)PBP4一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，編碼PBP4主要活性部位的基因SXXK,SXN及KIG與A型件內(nèi)酞胺酶是同源的⑧。在PBP4的SXXK與SXN之間有一區(qū)間，不同菌株P(guān)BP4氨基的順序可在這區(qū)間刪除不等量氨基酸，與原PBP4蛋白比較，分子量可從1%至79%不等，但對(duì)基本功能影響甚少⑨。

PBPS具梭基膚酶活性，缺乏PBPS的變異株對(duì)某些抗生素特別敏感，而且PBP5功能受PBP2影響。在缺乏PBP4與PEPS的變異株中，其功能可由PBP3完成。PBPS有膜型和游離型兩種，其中游離型可在細(xì)胞內(nèi)形成結(jié)晶⑩。在PBP5梭基端有一約100個(gè)氨基酸的末端，切除此末端仍保留PBP5蛋白與青霉素結(jié)合能力及酶活性，但容易被蛋白酶降解，說明這個(gè)撥基末端具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用⑾。

PBP6不具梭基膚酶活性，但在細(xì)菌靜止期有穩(wěn)定膚聚糖結(jié)構(gòu)的作用。過量PBP6在胞漿內(nèi)表達(dá)，可增加胞內(nèi)胞膜小泡形成⑿。

肺炎球菌主要有6種PBP蛋白，分別為高分子的PBPla. PBP16, PBP2x, PBP2a,PBP2b及低分子的PBP3。在耐青霉素菌中，PBPs譜及PBP2b,PBP2x基因序列有較大差異。但敏感株P(guān)BPs譜卻十分類似⒀。用血清學(xué)分離的菌株中，同一血清型PBPs譜亦有變異.很少有PBPs譜完全相同的菌株。

用基因分析的方法研究肺炎球菌中P$P1a,26,2x發(fā)現(xiàn)去除PBP2x,26基因，細(xì)菌不能存活，而缺乏PBPla的菌株可以獲得，說明PBP2x, 26是細(xì)菌生長(zhǎng)必需蛋白質(zhì)。PBPla對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)及對(duì)苯哇西林敏感性影響均不大⒁。

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青霉素結(jié)合蛋白研究進(jìn)展

PBP2x為肺炎球菌對(duì)頭抱唾肪敏感株的主要作用靶位，而在耐株中則成為數(shù)個(gè)靶位中的一個(gè)⒂ PBP2x具催化不同酷類及硫醇酷底物水解與轉(zhuǎn)膚反應(yīng).其催化活性與鏈霉菌R61的D.D-膚酶相似⒃�，F(xiàn)已能應(yīng)用基因工程合成PBP2x水溶性衍生物，且在時(shí)可得到結(jié)晶。該結(jié)晶能阻斷頭抱菌素衍生物的生色反應(yīng)，說明此結(jié)晶具有酶活性⒄。肺炎球菌對(duì)青霉素耐藥都由于出現(xiàn)高分子PBP2x基因，耐藥菌與敏感菌比較，耐藥株基因變異大。因基因變異起源于不同菌株間基因重組，就象PBP2b一樣，耐藥株P(guān)BP2x基因轉(zhuǎn)移了使敏感株轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幹辎症?

PBP3為D,D-梭膚酶，對(duì)細(xì)菌胞膜性質(zhì)影響很大。PBP3含量減少可使細(xì)菌對(duì)高溫、甘氨酸及一些D-氮基酸特別敏感，且可使細(xì)菌對(duì)頭抱唾肘產(chǎn)生耐藥}⒇, PBP3的氨基酸序列與大腸桿菌PBPS,PBP6及枯草桿菌PEPS非常相似。PBP3以C端定位于胞膜.缺乏PBP3的細(xì)菌成不規(guī)則形態(tài)，體積增大，分裂嚴(yán)重受阻。在胞內(nèi)多部位出現(xiàn)異常中隔，并產(chǎn)生厚薄不一的胞壁。

　　3不同PBP與卜內(nèi)酞胺類結(jié)合能力及卜內(nèi)酸胺類的聯(lián)用

各種抗生素與PBP3親和力均不同，因此抗菌活性亦不同。作用于不同PBP的壓內(nèi)酞胺類在聯(lián)用時(shí)可產(chǎn)生協(xié)同作用。不同PBP與抗生素親和力用玩表示(表1-3)。

　　美西林、克拉維酸可特異地與PBP2結(jié)合，多種青霉素、頭飽菌素與PBPla親和力較高。頭飽拉定、頭抱哇林與PBP 1b親和力高。頭飽氨節(jié)、氨曲南、furazolocillin與PBP6親和力較高.許多抗生素與PBPlbs及PBP3結(jié)合力往往有較大差異，因此聯(lián)用時(shí)往往可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

美西林由于其特異地作用于PBP2，與較多作用于PBPI.PBP3的抗生素可產(chǎn)生協(xié)同作用，已證實(shí)其與氮節(jié)西林、阿莫西林、狡節(jié)西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、呱拉西林、頭抱唾吩、頭泡哇林、頭抱氨節(jié)、頭抱拉定‘、頭飽孟多、頭飽西丁均呈協(xié)同抗菌作用⑥。

克拉維酸亦是特異地與PBP2結(jié)合，其與件內(nèi)酞胺類的協(xié)同作用是公認(rèn)的，但由于克拉維酸是A-內(nèi)酞胺酶的抑制劑，因此協(xié)同作用可由此特性而產(chǎn)生。但有人發(fā)現(xiàn)克拉維酸與卜內(nèi)酞胺類合用在一些不產(chǎn)酶菌中亦有協(xié)同表現(xiàn)，這就與其特異性結(jié)合PBP2相關(guān)(表4)。

[2]

　　這方面研究資料并不太多，但如果我們能切實(shí)找到與PBP作用點(diǎn)相應(yīng)的抗生素，那么這在聯(lián)合用上將是有效的。

　　4 PBPs譜變異與耐藥性產(chǎn)生

PBPs譜包括PBP種類及其百分含量.由于不同菌株的PBP譜有其特異性，現(xiàn)已成為細(xì)菌的一種分類方式。PBPs為抗生素的作用靶位，按此分類有助于對(duì)細(xì)菌耐藥性的推測(cè)及估價(jià)。人們認(rèn)識(shí)到PBPs譜的變異與細(xì)菌耐藥性密切相關(guān)。

　　分離耐亞胺培南的不動(dòng)桿菌，其PBPs與青霉素的結(jié)合能力下降，該菌株不產(chǎn)生卜內(nèi)酥胺酶，其耐藥性主要同PBPs蛋白變異所致，比較腸球菌的PBPs發(fā)現(xiàn)，25株中13株具附加77kDa PBP(PBP6')，而其它菌株均有52kDa PBP (PBP7)和46kDa PBP<PBPB),PBP6與青霉素敏感性關(guān)系不大，但PBP7與細(xì)菌耐藥性卻密切相關(guān)。對(duì)耐青霉素奈瑟球菌的研究亦發(fā)現(xiàn)PBP2結(jié)構(gòu)改變，且其與抗生素的結(jié)合能力下降。PBP2基因譜中，耐藥菌株與敏感菌株僅在一個(gè)175bp基因段差異較大。肺炎鏈球菌耐藥株中PBPs基因轉(zhuǎn)移至敏感株可使敏感株變?yōu)槟退幹辍?/P>

　　5耐藥基因溯源

　　關(guān)于耐藥基因來源問題分歧很多，有人認(rèn)為可通過基因突變，還有人認(rèn)為是通過不同菌株間的基因轉(zhuǎn)移�，F(xiàn)在又有人實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象。在諾卡菌產(chǎn)生頭霉素基因中含3種基因片段:一為典型的編碼卜內(nèi)酞胺酶基因;一為編碼PBP基因;另一為編碼穿透胞膜蛋白基因，諾卡菌的各內(nèi)酞胺酶與臨床分離細(xì)菌中A型(β-內(nèi)酞胺酶十分相似，此a-內(nèi)酞胺酶對(duì)青霉素有活性，但對(duì)頭霉素?zé)o作用，在諾卡菌中有8種PBPs，無一與頭霉素結(jié)合，另一胞膜蛋白與抗生素合成及分泌的控制有關(guān).其抗生素、卜內(nèi)酞胺酶與PBPs產(chǎn)生均保持平衡，是其存活的條件在該實(shí)驗(yàn)中，可以看到在一個(gè)產(chǎn)生抗生素的微生物中，存在制衡現(xiàn)象.整個(gè)微生物界亦如生物圈一樣存在生存的競(jìng)爭(zhēng)及制衡現(xiàn)象，我們應(yīng)用抗生素也正是利用了微生物界的這種制衡關(guān)系。但耐藥基因是否亦是由此而來，即產(chǎn)抗生素的菌對(duì)敏感菌高度抑制使其表現(xiàn)為“失衡”而敏感菌從產(chǎn)抗生素的菌株得到耐藥基因再次出現(xiàn)制衡，這是一個(gè)有趣而耐人尋味的問題.在控制耐藥菌感染中，能否再次利用這種現(xiàn)象，以提供有效的治療手段是值得探索的。

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