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葫蘆茶根中總多酚提取富集工藝研究
【摘要】 目的優(yōu)選葫蘆茶根中總多酚提取富集工藝。方法以總多酚含量為考察指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法優(yōu)選葫蘆茶根中總多酚的提取工藝，并優(yōu)選D101型大孔樹(shù)脂富集葫蘆茶根中總多酚的最優(yōu)條件。結(jié)果優(yōu)化條件結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，確定其最佳提取工藝條件為30℃，50%丙酮，8倍量溶劑提取3次，4.5 h/次，此條件下總多酚收率大于6%。以D101型大孔樹(shù)脂對(duì)總多酚進(jìn)行富集，最佳工藝條件為2 BV/h流速，收集6 BV 30%乙醇洗脫液，總多酚含量為77.2%，收率為32.3%。結(jié)論 該法能有效提取富集葫蘆茶根中總多酚。
【關(guān)鍵詞】 葫蘆茶; 總多酚; 提取; 富集; 正交設(shè)計(jì)
葫蘆茶系豆科葫蘆茶屬植物葫蘆茶Tadehagi triquetrum (L.) Ohashi的全草，為民間常用中草藥，主產(chǎn)于廣西、江西、廣東、福建等地[1，2]。本品性涼，味微苦、澀，具有清熱解毒、消積利濕、殺蟲(chóng)防腐等功效，臨床用于預(yù)防中暑，治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、急性腎炎、黃疸肝炎、腸炎、細(xì)菌性痢疾、妊娠嘔吐等[3]。目前對(duì)該植物的化學(xué)成分和生物活性的研究已有報(bào)道[4~6]，發(fā)現(xiàn)其具有抑菌和殺滅椎實(shí)螺的作用。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)葫蘆茶根中多酚類成分具有較強(qiáng)的殺軟體動(dòng)物作用，因此我們對(duì)其富含的多酚類成分的提取和富集工藝進(jìn)行了考察，旨在提高總多酚的收率，為其綜合開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
1 儀器與試藥
Unico7200可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司);Laborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph公司); BP210S十萬(wàn)分之一電子天平(Sartorius公司);V-560紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Jasco公司) 葫蘆茶全草，2006-03采集于廣西壯族自治區(qū)平南縣，經(jīng)遼寧師范大學(xué)陳辰教授鑒定為T(mén)adehagi triquetrum (L.) Ohashi;沒(méi)食子酸(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：ZL20090403YG，純度99.68%);D101型大孔吸附樹(shù)脂(天津海光化工有限公司);所用試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。
2 方法與結(jié)果
2.1 總多酚含量測(cè)定方法[7~9]
2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品10 mg，置于100 ml棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25 ml，置于100 ml棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.025 mg/ml的對(duì)照品溶液。分別精確吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5ml置于10 ml棕色容量瓶中，各加水至5 ml，再分別加入Folin試劑1 ml，用29% Na2CO3溶液稀釋至刻度，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白，30 min后，在754 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程C=3.023A + 0.0405(r=0.999 5)，其線性范圍為0.002 5～0.012 5 mg/ml。
2.1.2 樣品溶液的測(cè)定準(zhǔn)確稱取30.0 g粉碎后葫蘆茶根，置于500 ml的圓底燒瓶中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)置的處理?xiàng)l件提取，回收溶劑后冷凍干燥，準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品50 mg，用水溶解，置于100 ml 的容量瓶中并定容。搖勻，精密量取10 ml置于100 ml的棕色容量瓶中定容，搖勻，準(zhǔn)確量取2 ml于10 ml棕色容量瓶中，按“2.1.1”項(xiàng)下自“各加水至5 ml”起，同法測(cè)定吸光度，計(jì)算總多酚的含量和收率。
2.2 葫蘆茶根中總多酚提取工藝優(yōu)選[10，11]
2.2.1 因素與水平 首先對(duì)溶媒濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，確定了各因素最佳條件分別為：60%丙酮，40℃，6 h，1∶8和3次。對(duì)各因素進(jìn)行綜合分析，固定提取次數(shù)3次，對(duì)溫度(A)，溶媒濃度(B)，提取時(shí)間(C)，料液比(D)進(jìn)行考察，以總多酚含量為考核指標(biāo)，按4因素3水平進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。各因素水平安排見(jiàn)表1表1 考察因素及水平水平A溫度T/℃B溶媒濃度(%)
2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 按L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2分析結(jié)果可知，在葫蘆茶總多酚的提取工藝中，各因素對(duì)提取效果的影響程度依次為A>B>C>D，最優(yōu)水平組合為A1B1C1D2，即最佳提取工藝為8倍量50%丙酮，30 ℃提取3次，4.5 h/次。
2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)精確稱取粉碎后葫蘆茶根30.0 g(平行6份)，置于500 ml的圓底燒瓶中，加入8倍量50%丙酮，30 ℃提取4.5 h，提取3次�；厥杖軇┖罄鋬龈稍�。按“2.1.2”項(xiàng)下操作在754nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。6次測(cè)定結(jié)果，總多酚平均含量為27.34%，總多酚平均收率為6.26%。結(jié)果表明確定的工藝條件優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)中的任何一組，且重復(fù)性較好，說(shuō)明確定的工藝合理。
2.3 葫蘆茶根中總多酚富集工藝優(yōu)選[12]
2.3.1 D101型大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理取一定量的D101大孔樹(shù)脂，95%乙醇浸泡24 h，將其裝入樹(shù)脂柱內(nèi)，先以95%乙醇洗至流出液中加3倍量水后無(wú)白色混濁現(xiàn)象，改用蒸餾水沖洗至無(wú)醇味，備用。表2 正交設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.3.2 靜態(tài)吸附量的確定在250 ml的錐形瓶中加入5 g預(yù)處理后的D101大孔吸附樹(shù)脂以及100 ml樣品溶液(濃度為9.36 mg/ml)。室溫條件下振蕩24 h，取上清液測(cè)定總多酚含量。計(jì)算物料平衡吸附量：q = (C0-C)V/G，式中C0和C分別是初始和平衡時(shí)溶液中總多酚的濃度(mg/ml)，V為供試品液的體積(ml)，G為樹(shù)脂量(g)。計(jì)算得D101樹(shù)脂對(duì)多酚的靜態(tài)吸附量為27.82 mg/g。
2.3.3 動(dòng)態(tài)吸附量的確定取30 g預(yù)處理后D101大孔樹(shù)脂裝入內(nèi)徑為2.5 cm的樹(shù)脂柱，取濃度為10.33 mg/ml的葫蘆茶根50%丙酮提取液，以2BV/h的流速連續(xù)通過(guò)樹(shù)脂柱，收集流出液，每30 ml收集1個(gè)洗脫餾分，測(cè)定每個(gè)洗脫餾分中總多酚濃度。結(jié)果表明，當(dāng)上柱樣品溶液加至300 ml時(shí)，D101大孔樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和。
2.3.4 D101樹(shù)脂洗脫條件的選擇洗脫劑濃度的考察：取30 g經(jīng)預(yù)處理后的D101大孔吸附樹(shù)脂裝柱，取5 g葫蘆茶根50%丙酮提取物，用水溶解，過(guò)濾，以2 BV/h的流速上柱，吸附完全后用蒸餾水及10%，30%，50%，95%乙醇，以2BV/h流速進(jìn)行洗脫，收集每個(gè)梯度洗脫液，濃縮干燥并進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，10%和30%乙醇洗脫液中總多酚含量高，收率為33.0%，所以選擇用水及30%乙醇進(jìn)行洗脫。表3 洗脫劑濃度對(duì)洗脫量的影響洗脫劑洗脫量m/mg總多酚含量(%)收率(%) 洗脫劑用量的確定：分別用水、30%乙醇對(duì)已飽和吸附的D101大孔吸附樹(shù)脂(柱體積為30 ml)進(jìn)行洗脫，分別用去離子水5個(gè)柱體積，30%乙醇8個(gè)柱體積進(jìn)行洗脫，測(cè)定每個(gè)洗脫體積中多酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表4從表4可以看出，水洗脫過(guò)程中從第2個(gè)柱體積開(kāi)始洗脫液中總多酚的含量大于50%，30%乙醇洗脫過(guò)程中從第7個(gè)柱體積開(kāi)始洗脫液中總多酚的含量小于70%，為富集葫蘆茶根中多酚，所以選用1BV的水洗脫后用6BV的30%乙醇洗脫采用洗脫條件為1BV的水洗脫，6BV的30%乙醇洗脫，洗脫流速為2BV/h，葫蘆茶根中總多酚富集在30%乙醇洗脫液部分，富集物中總多酚含量為77.2%，收率為32.3%。表4 洗脫劑用量的影響水洗脫洗脫體積編號(hào)多酚含量(%)
3 討論
在對(duì)葫蘆茶根殺軟體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的殺軟體動(dòng)物作用，經(jīng)化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)其富含多酚類成分[9]，因此我們對(duì)葫蘆茶根中富含的多酚類成分的提取和富集工藝進(jìn)行了優(yōu)化。確定了最佳提取工藝條件為30℃，50%丙酮，8倍溶劑提取3次，4.5 h/次，此條件下總多酚收率大于6%。以D101型大孔樹(shù)脂對(duì)總多酚進(jìn)行富集，最佳工藝條件為2 BV/h流速，收集6 BV 30%乙醇洗脫液，總多酚含量為77.2%，收率為32.3%。D101樹(shù)脂對(duì)葫蘆茶多酚的吸附容量大，吸附性能穩(wěn)定，吸附柱可按比例放大用于工業(yè)富集葫蘆茶多酚。
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