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穿心蓮種子蛋白質(zhì)電泳鑒定的初步研究
【摘要】 目的探討SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)穿心蓮種子進(jìn)行鑒別的可行性，為穿心蓮種子鑒別及育種研究提供科學(xué)依據(jù)。方法 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)廣東省幾種不同來源和不同采收期的穿心蓮種子進(jìn)行可溶性蛋白質(zhì)電泳研究。結(jié)果 不同產(chǎn)地的穿心蓮種子蛋白質(zhì)電泳圖譜之間在譜型和譜帶的強(qiáng)弱、蛋白質(zhì)相對(duì)含量上均有一定的差異，不同采收期穿心蓮種子蛋白質(zhì)電泳在蛋白質(zhì)譜帶的強(qiáng)弱上有一定差異。結(jié)論 聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)可用于穿心蓮種子鑒定。
【關(guān)鍵詞】 穿心蓮;聚丙烯酰胺凝膠電泳;種子;鑒定
Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of seed identification with SDS-PAGE,and provide scientific basis for breeding of Andrographis paniculata.Methods SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis technology was adopted for analyzing soluble proteins of several different sources and different collection time in Guangdong.Results Significant differences were observed in spectral pattern,contents of proteins and intensity of bands of Andrographis paniculata from different origins,and in spectral degree between various collection time.Conclusion Polyacrylamide gel electrophoresis technology can be used for seed identification of Andrographis paniculata seeds.
Key words:Andrographis paniculata; polyacrylamide gel electrophoresis; seed; identification
穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees為爵床科植物，具有清熱解毒、涼血消腫等功能,臨床上常用于急性菌痢、胃腸炎、感冒、流腦、氣管炎、高血壓等疾病的治療[1]。研究表明，不同產(chǎn)地、不同采收期的穿心蓮性狀、成分差異較大，種子混雜現(xiàn)象也較嚴(yán)重[2]。中藥材種子所含蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量攜帶了其長(zhǎng)期演化的遺傳特征，具有很高的穩(wěn)定性和專屬性，其真?zhèn)魏推贩N鑒別是中藥集約化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)和前提。1991年國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)將蛋白質(zhì)電泳方法正式定為標(biāo)準(zhǔn)的品種鑒定方法。目前，蛋白質(zhì)電泳技術(shù)迅速發(fā)展和日臻完善，但大多應(yīng)用于玉米、棉花等植物中[3-4]，應(yīng)用于藥用植物的研究尚為數(shù)不多[5-7]。筆者收集了幾種不同產(chǎn)地和不同采收期的穿心蓮種子，利用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，旨在為穿心蓮種質(zhì)資源的保護(hù)、評(píng)價(jià)，種子的鑒定及育種提供參考依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
采集4個(gè)不同地區(qū)和同一地區(qū)3種不同采收期的成熟穿心蓮果實(shí)，室溫下陰干，待果皮自然裂開彈出種子。收集于種子瓶中置室溫陰涼處保存，各種子來源見表1。
1.2儀器與試劑
DYY-11型電泳儀(北京市六一儀器廠)，DYCZ-24DN雙垂直平電泳槽(北京市六一儀器廠)，TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)、HK3300H超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，PHS-30酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，HC-TP12-2型架盤藥物天平(北京醫(yī)用天平廠)。表1穿心蓮種子來源2 mol·L-1 Tris-HCl(pH=8.8)，1 mol·L-1Tris-HCl(pH=6.8)，10%(質(zhì)量濃度)SDS，50%(體積分?jǐn)?shù))甘油，1%(質(zhì)量濃度)溴酚藍(lán)，考馬斯亮藍(lán)R-250染液(取0.04 g考馬斯亮藍(lán)R-250，加入甲醇18 mL、蒸餾水18 mL和冰醋酸4 mL，即得)，考馬斯亮藍(lán)脫色液(10 mL甲醇、10 mL冰醋酸和80 mL蒸餾水混勻)，30%(質(zhì)量濃度,下同)丙烯酰胺，0.8%N，N’-甲叉雙丙烯酰胺，10%SDS，10%過硫酸銨，1%溴酚藍(lán)。
1.3方法
1.3.1樣品緩沖液的制備取1 mol·L-1的Tris-HCl 0.6 mL，加入50%(體積分?jǐn)?shù))的甘油5 mL、10%(體積分?jǐn)?shù))的SDS 2 mL、 2-硫基乙醇0.5 mL、1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))溴酚藍(lán)1 mL和蒸餾水0.9 mL，4 ℃冰箱中存放，備用。
1.3.2丙烯酰胺儲(chǔ)存液100 mL(A液)30%丙烯酰胺、0.8%雙丙烯酰胺。
1.3.34×分離膠緩沖液100 mL(B液)2 mol·L-1Tris-HCl 75 mL、10%SDS 4 mL，蒸餾水21 mL。
1.3.44×濃縮膠緩沖液100 mL(C液)取1 mol·L-1 Tris-HCl 50 mL，加入10%SDS 4 mL，再加入蒸餾水46 mL，即得。
1.3.55%濃縮膠蒸餾水2.3 mL，A液0.67 mL，C液1.0 mL，10%過硫酸銨30 μL，TEMED 5 μL。
1.3.612%分離膠A液4 mL，B液2.5 mL，蒸餾水3.5 mL，10%過硫酸銨50 μL，TEMED 5 μL。
1.3.7樣品溶液的制備[8]取穿心蓮種子0.5 g，加入稀釋5倍的樣品緩沖液(pH6.8)2 mL，3%聚乙烯毗咯烷酮(PVP)，冰浴下研磨，加入稀釋4倍的5%濃縮膠緩沖液1 mL，振搖，混勻，超聲20 min，室溫離心20 min(4 000 r·min-1)。取上清液，離心20 min(4 000 r·min-1)， 取上清液， 加入石油醚 2 mL，振搖2 min，靜止分層。吸取下層液體，加入適量冷丙酮，振搖，置4 ℃冰箱30 min，取出，離心5 s(4 000 r·min-1)，棄去丙酮，風(fēng)干。沉淀物加入樣品緩沖液2～3 mL，振搖2 min，超聲5～10 min，待溶解完全后，室溫下離心5 min(4 000 r·min-1)，取上清液，置4 ℃冰箱中存放，備用。
1.3.8電泳緩沖液的配制取Tris堿3 g、甘氨酸14.4 g和SDS 1 g， 加入蒸餾水至1 L， pH 8.3， 在 4 ℃冰箱中存放，備用。
1.3.9電泳操作采用1 mm厚的SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度12%，電極緩沖液為Tris-甘氨酸，pH8.3。用微量注射器分別取樣品液25 μL，注入樣品槽底部，點(diǎn)樣結(jié)束后向上槽內(nèi)加入1滴溴酚藍(lán)指示劑示蹤。起始電壓控制在120 V，樣品進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)整為200 V，待指示劑距前沿約1 cm時(shí)，停止電泳，迅速取出膠板，標(biāo)記前沿。
1.3.10染色和脫色取出膠板后，用蒸餾水沖洗，隨即放入考馬斯亮藍(lán) R250顯色液中，置恒溫箱中38 ℃染色2 h 后取出，多次更換脫色液(甲醇10 mL、冰醋酸10 mL和蒸餾水80 mL)，至背景清晰為止。拍照、記錄。
2結(jié)果與分析
2.1電泳結(jié)果不同產(chǎn)地和不同采收期的穿心蓮種子蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖1，根據(jù)此繪制的電泳圖譜見圖2。
結(jié)果顯示，不同來源、同一產(chǎn)地不同采收期的穿心蓮種子可溶性蛋白質(zhì)電泳圖譜共有11條共有特征帶，且譜帶清晰，Rf值分別為：0.460、0.471、0?482、0.495、0.512、0.524、0.538、0.825、0.921、0?937，表示其具有的共同遺傳基礎(chǔ)，可作為鑒定穿心蓮種子的重要標(biāo)記。以一級(jí)帶、二級(jí)帶作為主要分析特征，不同產(chǎn)地及不同采收期的穿心蓮種子蛋白質(zhì)譜帶具有多條共同譜帶，但廣東省農(nóng)科院白云基地采收種子的電泳譜帶數(shù)目與其他種子有較大差異，有10條特征帶。在三級(jí)帶、四級(jí)帶和五級(jí)帶上，一些譜帶的數(shù)目、遷移率有一定差異。
2.2 蛋白相對(duì)百分含量為了分析蛋白表達(dá)量，利用凝膠圖像分析軟件Band Scan對(duì)電泳蛋白圖譜進(jìn)行分析，其中由于有部分譜帶的灰度值太低，難以測(cè)出其所在區(qū)域的蛋白含量�？蓽y(cè)得的目的蛋白占總蛋白的百分?jǐn)?shù)結(jié)果見表2。[PSa6121〗 a～f.分別是編號(hào)為a～f的穿心蓮種子圖1穿心蓮種子可溶性蛋白電泳圖譜[PSa6122;S*2〗圖2穿心蓮種子可溶性蛋白電泳圖譜分析圖結(jié)果表明，不同來源地和不同采收期的穿心蓮種子蛋白表達(dá)量亦存在差異。
3討論
穿心蓮?fù)ǔＪ欠N子繁殖,故種子的鑒定及其品質(zhì)極為重要。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)產(chǎn)物，具有一定的穩(wěn)定性，但亦會(huì)受環(huán)境的影響而發(fā)生基因的變異，形成不同的生態(tài)型甚至變種。本研究首次利用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)廣東省4個(gè)不同來源地的穿心蓮種子及同一產(chǎn)地不同采收期的穿心蓮種子水溶性蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)電泳的初步研究。研究結(jié)果表明，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)可作為鑒定穿心蓮種子的生物指征。此外，同一來源不同采收期的穿心蓮種子蛋白質(zhì)電泳圖譜在譜帶數(shù)目、遷移率上具有較高相似性，在蛋白質(zhì)相對(duì)含量上則呈現(xiàn)出一定的差異，提示可以作為穿心蓮種子成熟以及最佳采收期的生化標(biāo)記，相關(guān)的研究將在下一步工作開展。表2穿心蓮種子可溶性蛋白電泳的蛋白表達(dá)量本研究表明了利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)穿心蓮種子進(jìn)行鑒定及種子品質(zhì)研究的可行性，為進(jìn)一步研究穿心蓮種質(zhì)資源的保護(hù)、評(píng)價(jià)及育種提供參考依據(jù)。
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