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正交試驗(yàn)法優(yōu)化香附總黃酮提取工藝
【摘要】 目的優(yōu)選香附總黃酮的提取工藝。方法 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，以總黃酮含量為測(cè)定指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化香附總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果 香附總黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶15、提取時(shí)間45 min、提取次數(shù)為2次。結(jié)論 該提取工藝穩(wěn)定，適合香附總黃酮的提取。
【關(guān)鍵詞】 香附;總黃酮;正交試驗(yàn);提取工藝
Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction technology of total flavonoids from Cyperus Rotundus. Methods Orthogonal experiment was designed with the content of total flavonoids as index,and with ethanol concentration,the ratio of material and solvent,extracting time and frequency as factors.Results The optimal extraction technology was as follows：70% ethanol,the ratio of material to solvent of 1∶15,extracting for 45 min and 2 times.Conclusion The extraction technology is steady and suitable for extracting total flavonoids from Cyperus Rotundus.
Key words:Cyperus Rotundus; total flavonoids;orthogonal experiment; extraction technology
香附為莎草科多年生草本莎草(Cyperus rotundus L.) 的干燥根莖，性辛、微苦、微甘、平,歸肝、三焦經(jīng)，具有疏肝理氣、調(diào)經(jīng)止痛的功效[1]。香附主要含有揮發(fā)油、黃酮類化合物、三萜類化合物、甾醇類、生物堿、糖類、酚類等化學(xué)成分[2]�，F(xiàn)有研究已證明黃酮類化合物在治療冠心病、老年性癡呆、腦血栓、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面有顯著效果，還具有抑菌、抗癌等作用，且無(wú)副作用，已開(kāi)發(fā)出許多種藥品和保健食品[3-5] 。已有的文獻(xiàn)資料未見(jiàn)有關(guān)香附黃酮類物質(zhì)提取工藝的研究報(bào)道，故本試驗(yàn)對(duì)香附總黃酮的提取工藝以及含量進(jìn)行初步研究，為香附總黃酮的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供資料。
1儀器與試藥
1.1儀器
Agilent8453E型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司);BP211D電子分析天平(德國(guó)Sartorius);KQ-500超聲儀(昆明市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率40 kHZ);層析柱(2.5 cm×14 cm)。
1.2試藥
香附藥材購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部雷龍副教授鑒定為莎草科植物(Cyperus rotundus L.) 的干燥根莖;蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：10080-200306)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;聚酰胺(30～60目，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);水為重蒸水;其余試劑均為分析純。
2方法與結(jié)果
2.1供試品溶液的制備
取香附粉末(過(guò)2號(hào)篩)3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加石油醚(60~90 ℃)50 mL，超聲提取30 min，棄去石油醚液，待樣品中殘留的石油醚全部揮去后，按實(shí)驗(yàn)要求加入不同體積乙醇(不同體積分?jǐn)?shù))超聲提取不同時(shí)間、次數(shù)，放涼后濾過(guò)，濾液置80 ℃水浴鍋上濃縮至適量。稱取聚酰胺3 g，以樣品溶液拌樣后置80 ℃水浴鍋上加熱至無(wú)醇味，裝入層析柱中。用蒸餾水100 mL、20%(體積分?jǐn)?shù))乙醇50 mL、60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇300 mL依次進(jìn)行洗脫，收集60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫液，置水浴鍋上濃縮，用60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇定容至25 mL，即得。
2.2對(duì)照品溶液的制備
精密稱取已干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20.08 mg，置10 mL容量瓶中，加60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶解至刻度，搖勻，即得。
2.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇
取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5%(質(zhì)量濃度)NaNO2 溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%(質(zhì)量濃度)Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，再放置6 min，加入4%(質(zhì)量濃度)NaOH溶液4 mL，加60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇定容到10 mL，放置15 min，即得。用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，結(jié)果兩者在499.9 nm處均有最大吸收，故選擇500 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。
2.4線性關(guān)系考察
分別精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置25 mL容量瓶中，按照“2.3”項(xiàng)下自“加入5%(質(zhì)量濃度)NaNO2 溶液0.3 mL ”起進(jìn)行操作，于500 nm處測(cè)定其吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=27.455ρ+0.018 7，r=0?999 0。結(jié)果表明蘆丁對(duì)照品的質(zhì)量濃度在0.040 16～0?401 6 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
2.5單因素考察
以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間為考察因素，考察其對(duì)總黃酮提取率的影響。結(jié)果見(jiàn)圖1。[PSa6381〗A.乙醇體積分?jǐn)?shù);B.料液比;C.提取時(shí)間圖13個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響Figure 1The effect on the extraction yield of 3 factors由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在80%時(shí)香附總黃酮提取率最高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)提高，總黃酮提取率反而下降;總黃酮提取率隨著料液比的增大而升高，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)達(dá)到最大值;提取時(shí)間為40 min時(shí)總黃酮提取率最高。
2.6正交試驗(yàn)
在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D) 4個(gè)因素為考察因素，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，確定香附總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果見(jiàn)表1-3。由表2、3可知，各個(gè)因素對(duì)香附總黃酮提取率影響程度從大到小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取次數(shù)>提取時(shí)間>料液比，4個(gè)因素對(duì)提取率的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)的需要，選擇最佳提取工藝條件為A1B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比為1∶15，提取時(shí)間為45 min，提取2次。表1因素水平表表2正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析表3正交試驗(yàn)方差分析表
2.7驗(yàn)證試驗(yàn)
分別取3份同一產(chǎn)地香附粉末，精密稱定，按上述確定的最佳工藝進(jìn)行提取，測(cè)定總黃酮提取率。結(jié)果表明，3份香附總黃酮平均提取率為 0.352 15%，RSD=2.11%，表明該提取工藝合理、穩(wěn)定。
3討論
3.1在試驗(yàn)中嘗試把樣品用石油醚脫脂后直接將醇提液進(jìn)行顯色后再掃描，結(jié)果提取液在500 nm處并無(wú)最大吸收，可能是其他成分對(duì)黃酮測(cè)定干擾較大所致。而用聚酰胺富集純化香附總黃酮類物質(zhì)后其乙醇洗脫液經(jīng)掃描，最大吸收波長(zhǎng)為500 nm，與蘆丁顯色后的最大吸收波長(zhǎng)一致。
3.2在考察聚酰胺柱洗脫溶劑時(shí)，采用了水、體積分?jǐn)?shù)分別為20%、40%、60%、70%、80%的乙醇液進(jìn)行洗脫，測(cè)定各洗脫液中總黃酮含量。結(jié)果表明用60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫時(shí)總黃酮含量最高，體積分?jǐn)?shù)為70%和80%乙醇的洗脫液中幾乎檢測(cè)不到總黃酮，故選擇的洗脫程序?yàn)椋合扔?00 mL 水洗去無(wú)機(jī)鹽離子，再用20%(體積分?jǐn)?shù))乙醇50 mL洗去酚類成分，最后用60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇300 mL進(jìn)行洗脫，收集60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗脫液。
3.3正交試驗(yàn)結(jié)果提示，本次試驗(yàn)所考察各因素對(duì)提取率的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)與各因素選擇范圍過(guò)窄有關(guān)�？煞襁M(jìn)一步降低乙醇體積分?jǐn)?shù)或(和)延長(zhǎng)提取時(shí)間，以使香附總黃酮被最大限度地提取出來(lái)，尚需繼續(xù)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，從而保證最終確定的提取工藝的實(shí)用性和科學(xué)性。
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