論Nogo受體拮抗劑對(duì)大鼠急性脊髓損傷的保護(hù)作用

摘要： 目的 探討Nogo受體拮抗劑NEP1-40對(duì)大鼠脊髓損傷后脊髓功能恢復(fù)的影響，為臨床治療急性脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 健康Wistar大鼠48只隨機(jī)分為創(chuàng)傷對(duì)照組、NEP1-40治療組。建立大鼠中段胸部脊髓后半部橫切模型。對(duì)照組注入生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組采用NEP1-40治療。分別在術(shù)后取材行蘇木精-伊紅染色、免疫熒光染色檢測(cè)。術(shù)后第1、3天及1、2、3、4周對(duì)動(dòng)物進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。結(jié)果 脊髓損傷3周后，NEP1-40組行為學(xué)評(píng)分高于對(duì)照組，同時(shí)NeuN/NF-200陽(yáng)性染色亦明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 NEP1-40治療脊髓損傷能促進(jìn)神經(jīng)元的再生，恢復(fù)脊髓功能。

關(guān)鍵詞： 大鼠；脊髓損傷；Nogo受體拮抗劑；再生

脊髓少突膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的Nogo蛋白是目前已知最強(qiáng)的神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子，對(duì)受損神經(jīng)元再生具有極強(qiáng)的抑制作用［1］。Nogo受體拮抗劑(Nogo extracellular peptide, residues 1-40，NEP1-40)為針對(duì)Nogo-66氨基序列設(shè)計(jì)的Nogo受體(Nogo receptor，NgR)競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，能拮抗中樞神經(jīng)抑制因子與NgR的結(jié)合，起到促進(jìn)神經(jīng)再生的作用［1-2］。本實(shí)驗(yàn)主要觀察NEP1-40對(duì)于急性脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響及對(duì)NF-200表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討NEP1-40治療急性脊髓損傷的療效和可能機(jī)制。
　　1 材料和方法
　　1.1 主要試劑
　　NEP1-40、兔抗大鼠NeuN 抗體、小鼠抗大鼠NF-200抗體、抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-RBITC，均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
　　1.2 動(dòng)物及分組
　　健康成年Wistar大鼠48只(由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)， 雌性，體重250～300 g，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、NEP1-40實(shí)驗(yàn)組。
　　1.3 動(dòng)物模型的制作
　　參照Brosamle等［3］方法制作脊髓半橫斷模型。大鼠經(jīng)腹腔麻醉后固定于立體定位儀上，常規(guī)消毒，以第8胸椎(T8)棘突為中心，手術(shù)顯露棘突。手術(shù)顯微鏡下打開(kāi)T8椎板，用刀片做T10脊髓的后半橫斷，損傷深度1.0 mm（橫斷后側(cè)和后外側(cè)皮質(zhì)脊髓束）。向尾側(cè)硬脊膜下置入硬脊膜管（PE-10導(dǎo)管，BD公司），鹽水沖洗切口，固定硬脊膜管，依次縫合，模型制作完成。

　　生理鹽水對(duì)照組通過(guò)置管每天注入生理鹽水20 μl，NEP1-40組每天用微量進(jìn)樣器注入NEP1-40 10 μl(0.4 μg/μl)。每天分早、中、晚3次注射，每次注射完畢后用10 μl生理鹽水沖管，以保證藥物進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，連續(xù)使用4周。術(shù)后人工擠壓膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。術(shù)后3天給予青霉素4萬(wàn)U／只。硬脊膜管外口予無(wú)菌保護(hù)，定期換藥。
　　1.4 標(biāo)本的收集和處理
　　所有動(dòng)物均分別于脊髓損傷1、2、3、4周時(shí)用4%多聚甲醛經(jīng)左心室-主動(dòng)脈灌注后取出脊髓組織，灌注液中固定12 h左右，然后放入30%蔗糖溶液中，待組織沉底，冰凍切片機(jī)切片，厚度30 μm。
　　1.5 檢測(cè)指標(biāo)
　　1.5.1 組織學(xué)檢查
　　蘇木精-伊紅染色，觀察脊髓的組織學(xué)改變。
　　1.5.2 免疫熒光組織化學(xué)雙重標(biāo)記染色
　　選取脊髓切片經(jīng)兔抗大鼠NeuN 抗體(1∶500)﹑小鼠抗大鼠NF-200抗體(1∶400)4℃孵育過(guò)夜，再用抗兔IgG-FITC(1∶100)﹑抗小鼠IgG-RBITC (1∶100)37℃孵育1 h，封片后用Leica激光共聚焦掃描顯微鏡觀察免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果。
　　1.6 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定
　　采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)［4］運(yùn)動(dòng)評(píng)分法。在80 cm×130 cm×30 cm覆蓋有防滑紙板的箱子中，每只實(shí)驗(yàn)鼠由2名非實(shí)驗(yàn)人獨(dú)自觀察4 min，對(duì)后肢的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。0～21分的分級(jí)是根據(jù)關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)、體重的支撐、前后肢的協(xié)調(diào)和尾的位置等情況而定。0分代表大鼠后肢無(wú)運(yùn)動(dòng)，21分表示大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能正常。BBB評(píng)分分別于術(shù)后第1、3、7、14、21、28天進(jìn)行。
　1.7 圖像分析
　　免疫組化染色結(jié)果采用德國(guó)KONTRONIBAS 2.5全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，在損傷的頭尾兩側(cè)，分別取10個(gè)視野，計(jì)算免疫熒光陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。
　　1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示。2組實(shí)驗(yàn)大鼠BBB評(píng)分，采用具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的兩因素設(shè)計(jì)的方差分析，比較不同時(shí)點(diǎn)指標(biāo)的變化趨勢(shì)。2組免疫熒光染色陽(yáng)性反應(yīng)的比較采用成組設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（雙側(cè)）：α=0.05。
　　2 結(jié)果
　　2.1 組織改變
　　4周時(shí)蘇木精-伊紅染色顯示生理鹽水對(duì)照組出現(xiàn)神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，細(xì)胞體積變小；白質(zhì)中見(jiàn)較多紅細(xì)胞滲出，髓鞘腫脹和大量空泡；并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠質(zhì)細(xì)胞增生。NEP1-40實(shí)驗(yàn)組灰質(zhì)腫脹變形、出血、小膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均較損傷組輕；白質(zhì)點(diǎn)狀出血，白質(zhì)中有較多的正常軸突(圖1)。
　　2.2 免疫組化

　　激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到脊髓損傷1、2、3、4周后神經(jīng)元的胞體和細(xì)胞核均增大，胞質(zhì)和軸突的NF-200免疫染色為陽(yáng)性，并且與NeuN共定位(圖2)。從NF-200染色陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)，脊髓損傷3周后NEP1-40實(shí)驗(yàn)組明顯高于生理鹽水對(duì)照組(P

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