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HPLC-MS/MS法測(cè)定兔血漿中黃芪甲苷的含量
【摘要】 目的建立兔含藥血漿中黃芪甲苷含量快速測(cè)定的新方法。方法固相萃取法富集血漿中的黃芪甲苷;Agilent SB-C18反相色譜進(jìn)行分離;采用離子阱質(zhì)譜多級(jí)反應(yīng)模式，以m/z 807.5→627.1為選擇離子對(duì)，內(nèi)標(biāo)法測(cè)定含量。結(jié)果血漿中黃芪甲苷的檢測(cè)限為0.1ng/mL，線性范圍為0.5～50.0μg/mL，平均方法回收率在96.3%～104.7%范圍內(nèi)。結(jié)論該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好和快速的特點(diǎn)，符合生物樣品的分析要求，有望用于黃芪甲苷的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
【關(guān)鍵詞】 黃芪;黃芪甲苷;固相萃取;HPLC-MS/MS
ABSTRACT: ObjectiveTo establish a new method for the determination of astragaloside Ⅳ in rabbit plasma by high performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry (HPLC-MS/MS).MethodsAstragaloside Ⅳ in plasma samples was enriched by solid phase extraction. The resulted samples were further separated by reverse phase chromatography with Agilent SB-C18 column. Multiple reaction mode of MS/MS was employed to determine the concentration of astragaloside Ⅳ by internal standard with m/z 807.5→627.1 as the selected ion pair.ResultsThe detection limit of astragaloside Ⅳ in plasma samples was 0.1ng/mL, the linear range was 0.5-50.0μg/mL, and the average recovery rate of the method was within the range of 96.3%-104.7%. ConclusionThe proposed method has the characteristics of high sensitivity, good stability and high speed. These properties can meet the requirements of the analytical method for biological samples, which indicates that the method may be used in pharmacokinetic study of astragaloside Ⅳ.KEYWORDS: Radix Astragali; astragaloside Ⅳ; solid phase extraction; high performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry (HPLC-MS/MS)
黃芪為中醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用的益氣中藥之一，味甘、性溫，具有補(bǔ)氣固表、脫毒和利尿等功效。中華人民共和國(guó)規(guī)定臨床所用黃芪藥材為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分之一，其含量測(cè)定方法主要包括薄層掃描法[2]和以紫外[3]和蒸發(fā)光散射[4]為檢測(cè)方法的高效液相色譜法。由于黃芪甲苷為紫外末端吸收物質(zhì)，上述方法雖能用于黃芪藥材及制劑中黃芪甲苷的含量測(cè)定，但靈敏度方面難以滿足生物樣品中黃芪甲苷的測(cè)定要求。本文采用固相萃取法對(duì)兔含藥血漿中的黃芪甲苷進(jìn)行富集，高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)進(jìn)行分離測(cè)定，旨在建立可用于黃芪甲苷藥代動(dòng)力學(xué)及在其他生物樣品中含量測(cè)定的新方法。
1材料與方法
1.1藥品與試劑黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，地高辛對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。黃芪藥材購(gòu)自陜西省中藥材公司，經(jīng)陜西省藥品檢驗(yàn)所鑒定為蒙古黃芪。乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，水為超純水(自制)，其他試劑均為分析純。
1.2儀器Agilent 1100系列液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(含二元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、離子阱質(zhì)量分析器及Agilent Chemstation 5.2控制軟件包)。Alltech公司固相萃取儀;Agilent C18固相萃取柱(500mg，6cc，美國(guó)安捷倫公司)。
1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大白兔，♀、♂各半，體重1.8～2.3kg，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：陜醫(yī)動(dòng)字第082018號(hào)。
1.4固相萃取柱的活化方法取安捷倫公司C18(500mg，6cc)固相萃取小柱安裝于固相萃取儀上，依次用10mL甲醇、20mL超純水、10mL 600mL/L甲醇溶液洗脫活化。
1.5供試品溶液的制備
1.5.1黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品5.0mg，置10.0mL量瓶中，用甲醇溶解并定容稀釋至刻度，制備成濃度為0.5mg/mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液。
1.5.2地高辛對(duì)照品溶液的制備精密稱取地高辛對(duì)照品3.0mg，置5.0mL量瓶中，用甲醇溶解并定容稀釋至刻度，制備成濃度為0.6mg/mL的地高辛儲(chǔ)備液。
1.5.3黃芪藥材的提取稱取黃芪藥材20.0g，干燥至恒重，粉碎，過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱取藥材粉末100.0g，加10倍量甲醇，冷浸過(guò)夜，超聲提取3次，每次30min，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮后制成干膏，研磨成粉，以羧甲基纖維素鈉懸浮，備用。
1.5.4空白血漿樣品溶液的制備取兔混合空白血漿0.5mL，加入地高辛對(duì)照品溶液10μL，置于2.0mL離心試管中，加入20μL濃度為10.0mol/L的三氯乙酸溶液，5000r/min離心5min，取上清液通過(guò)已活化好的固相萃取小柱，先用3.0mL水洗脫，再用2.0mL甲醇洗脫。收集甲醇洗脫液，40℃氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)昧鲃?dòng)相溶解，0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，冷藏備用。
1.5.5含藥血漿樣品的制備新西蘭大白兔3只，12h禁食不禁水，以黃芪甲苷劑量為2.0mg/kg(相當(dāng)于每公斤4.0g藥材)灌胃給予黃芪藥材提取液。分別于給藥后0、10、30和60min耳緣靜脈取血1.5mL，肝素抗凝，離心制備血漿。取血漿0.5mL，加入地高辛對(duì)照品溶液10.0μL，置于2.0mL離心試管中，加入20.0μL濃度為10.0mol/L的三氯乙酸溶液，5000r/min離心5min，取上清液通過(guò)已活化好的固相萃取小柱，先用3.0mL水洗脫，再用2.0mL甲醇洗脫。收集甲醇洗脫液，40℃氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)昧鲃?dòng)相溶解，0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，冷藏備用。
1.6分析條件色譜柱為Agilent SB-C18柱(5μm，4.6mm×150mm);流動(dòng)相為甲醇-5.0mmol/L乙酸水(75∶25，V∶V);流速為0.8mL/min;柱后2∶1分流，三分之一流出液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜條件為：電噴霧正離子模式檢測(cè);霧化氣壓力為40.0psi;干燥氣溫度為325℃，流速為9.0L/min;黃芪甲苷選擇m/z 807.4→627.2為離子對(duì)，地高辛選擇m/z 803.5→m/z 785.1為離子對(duì);質(zhì)量掃描范圍為100～1500amu。
2結(jié)果
2.1專(zhuān)屬性和檢測(cè)限精密吸取兔混合空白血漿0.5mL，按空白血漿樣品制備方法制備供試品溶液。在擬定分析條件下，進(jìn)樣20.0μL，得提取離子流圖(圖1)。另取兔混合空白血漿3份，每份0.5mL，分別加入10.0μL地高辛對(duì)照品溶液和5.0μL黃芪甲苷對(duì)照品溶液，按空白血樣樣品制備方法制備供試品溶液，在擬定分析條件下，進(jìn)樣20.0μL，得提取離子流圖(圖2)。由圖1和圖2可見(jiàn)，采用多級(jí)反應(yīng)模式，擬定分析條件下，血漿中的其他物質(zhì)不干擾黃芪甲苷的分析測(cè)定。逐級(jí)減小空白血漿中地高辛和黃芪甲苷對(duì)照品溶液的添加量，按空白血漿樣品制備方法制備供試品溶液，擬定分析條件下測(cè)得血漿中黃芪甲苷的檢測(cè)限為0.1ng/mL(S/N=3)。圖1空白血漿供試品溶液黃芪甲苷和地高辛提取離子流圖Fig.1 Extract ion chromatogram of astragaloside Ⅳ and digoxin in blank plasma
2.2線性范圍取空白血漿8份，每份0.5mL，分別加入適量黃芪甲苷對(duì)照品溶液，使血漿中黃芪甲苷的濃度分別為50.0，25.0，12.5，5.0、2.5、1.0、0.5和0.05μg/mL，分別加入10μL地高辛對(duì)照品溶液，按空白血漿樣品制備方法制備供試品溶液。在擬定分析條件下，分別吸取20μL，進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芪甲苷和地高辛提取離子流圖的峰面積。以兩者峰面積的比值為縱坐標(biāo)，黃芪甲苷的濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0.05～50.0μg/mL范圍內(nèi)，黃芪甲苷和地高辛提取離子流圖峰面積的比值與黃芪甲苷的濃度呈非線性關(guān)系，但在0.5～50.0μg/mL卻存在較好的線性關(guān)系。進(jìn)一步在0.5～50.0μg/mL范圍內(nèi)，將黃芪甲苷和地高辛提取離子流圖峰面積的比值與黃芪甲苷的濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.02x+0.16，相關(guān)系數(shù)r=0.9994，提示血漿中黃芪甲苷的線性范圍為0.5～50.0μg/mL。圖2空白血漿加標(biāo)供試品溶液黃芪甲苷和地高辛提取離子流圖Fig.2 Extract ion chromatogram of astragaloside Ⅳ and digoxin in blank plasma with addition of5μL astragaloside Ⅳ and 10μL digoxin standardA：地高辛;B：黃芪甲苷。
2.3回收率
2.3.1提取回收率取空白血漿和水各3份，每份0.5mL，分別加入適量的黃芪甲苷對(duì)照品溶液和10.0μL地高辛對(duì)照品溶液，使空白血漿和水中黃芪甲苷的的濃度分別為為1.5、7.5和40μg/mL(高、中、低)，按空白血漿樣品制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20.0μL，測(cè)定黃芪甲苷含量。分別以血漿和水溶液中黃芪甲苷含量之比計(jì)算提取回收率，得高、中、低3個(gè)濃度黃芪甲苷的提取回收率分別為98.4%、101.2%和95.5%，提示黃芪甲苷具有較好的提取回收率。
2.3.2方法回收率分別精密吸取高、中、低3個(gè)濃度的空白血漿加標(biāo)供試品溶液20.0μL，在分析條件下，進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芪甲苷的含量。以測(cè)定量與加入量的比值計(jì)算方法回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷的回收率分別為100.2%、96.3%和104.7%，提示方法具有較高的回收率。
2.4精密度實(shí)驗(yàn)分別取高、中、低3個(gè)濃度的空白血漿加標(biāo)供試品溶液，在擬定分析條件下，1d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)定黃芪甲苷的含量，計(jì)算得日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.4%、6.7%和2.6%。將上述3個(gè)濃度的樣品溶液分別在6d內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)定黃芪甲苷含量，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.8%、6.3%和8.2%，表明方法具有良好的日內(nèi)和日間精密度。
2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)
2.5.1凍融穩(wěn)定性取添加有高、中、低3個(gè)濃度黃芪甲苷對(duì)照品溶液和10.0μL地高辛對(duì)照品溶液的空白血漿，在-20℃下冷凍24h，自然解凍后，按照空白血漿樣品制備方法制備供試品溶液。擬定分析條件下，進(jìn)樣20.0μL，測(cè)定黃芪甲苷含量。然后將血漿樣品重新冷凍24h，重復(fù)試驗(yàn)6次，計(jì)算凍融周期對(duì)黃芪甲苷穩(wěn)定性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個(gè)凍融周期對(duì)血漿中黃芪甲苷的測(cè)定無(wú)顯著影響。
2.5.2短期穩(wěn)定性取添加有高、中、低3個(gè)濃度黃芪甲苷對(duì)照品溶液和10.0μL地高辛對(duì)照品溶液的空白血漿，室溫下放置2、4、6、8、10、12和24h后，按空白血漿樣品制備方法制備供試品溶液。擬定分析條件下，進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芪甲苷的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品在24h范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.5.3長(zhǎng)期穩(wěn)定性取添加有高、中、低3個(gè)濃度黃芪甲苷對(duì)照品溶液和10.0μL地高辛對(duì)照品溶液的空白血漿，在-70℃下冷凍貯存1、2、4、8周后解凍，按空白血漿樣品制備方法制備供試品溶液。擬定色譜條件下，進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芪甲苷含量，計(jì)算冷凍保存時(shí)間對(duì)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿樣品-70℃下冷凍儲(chǔ)存8周，對(duì)黃芪甲苷的測(cè)定無(wú)顯著影響。
2.5.4后期穩(wěn)定性取添加有高、中、低3個(gè)濃度黃芪甲苷對(duì)照品溶液和10μL地高辛對(duì)照品溶液的空白血漿，按空白血漿樣品制備方法制備供試品溶液，室溫下放置2、4、8、12、24和48h后，進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芪甲苷含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿供試品溶液中黃芪甲苷在48h內(nèi)穩(wěn)定。
2.6樣品測(cè)定分別取10、30和60min時(shí)間點(diǎn)采集的血漿樣品，按含藥血漿樣品制備方法制備供試品溶液。擬定分析條件下，進(jìn)樣20μL，測(cè)定黃芪甲苷的濃度，結(jié)果表明，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)所得含藥血漿中黃芪甲苷的濃度分別為5.2、8.4和7.6μg/mL。
3討論
黃芪甲苷的紫外吸收較弱，采用紫外檢測(cè)法進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，一般選擇203nm，因此具有靈敏度差等不足，難以滿足生物樣品中黃芪甲苷的測(cè)定要求[5]。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器雖然能用于黃芪甲苷的測(cè)定，但對(duì)于生物樣品而言，其靈敏度仍需進(jìn)一步的提高。質(zhì)譜法以氣態(tài)離子為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)靈敏度僅與檢測(cè)對(duì)象的離子化程度密切相關(guān)，而不受其紫外光吸收性質(zhì)的限制，在紫外末端吸收物質(zhì)的測(cè)定方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，本文選擇質(zhì)譜法為手段，測(cè)定黃芪甲苷的含量。
已有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定黃芪甲苷在兔血漿中的濃度[5]，但給藥對(duì)象為黃芪甲苷單體，且飛行時(shí)間質(zhì)譜一般適用于大分子量物質(zhì)的分析，對(duì)于黃芪甲苷而言，其選擇性還值得進(jìn)一步的探討。本文采用離子阱質(zhì)譜的多級(jí)反應(yīng)模式即選擇離子對(duì)法測(cè)定血漿樣品中的黃芪甲苷。由于該方法同時(shí)以準(zhǔn)分子離子和二級(jí)碎片離子對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行定性，因此能有效排除血漿中基質(zhì)的干擾，從而不僅具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，而且能有效縮短分析時(shí)間，提高靈敏度。綜上，本文所建立的兔含藥血漿中黃芪甲苷的HPLC-MS/MS測(cè)定方法具有快速、穩(wěn)定和靈敏度高的特點(diǎn)，能用于黃芪甲苷的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布研究。
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