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耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因多態(tài)性分型研究
【摘要】 目的探索一種準確、快速、可靠的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的分子生物學分型方法，了解醫(yī)院內(nèi)MRSA的多態(tài)性，為臨床合理、有效地使用抗生素和控制耐藥基因在種群間的傳播提供幫助。方法用MecA基因相關高變區(qū)PCR擴增(HVR-PCR)和隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)兩種方法，對MRSA菌株進行多態(tài)性分析。HVR-PCR檢測MecA基因相關高變區(qū)正相重復序列元件(DRUs)的長度，根據(jù)DRUs數(shù)目的不同對MRSA分型;RAPD根據(jù)電泳圖譜中條帶的數(shù)目及位置，經(jīng)NTSYS統(tǒng)計軟件進行聚類分析，得到遺傳樹狀圖，按MRSA菌株之間的相關性進行分型。結(jié)果應用HVR-PCR方法可將31株MRSA標本分為7型，分別含有7、8、9、10、11、12和16個DRUs，其中10DRUs型最多\[11/31(35.48%)\]，16DRUs型最少\[1/31(3.23%)\];應用RAPD分型，31株MRSA共分10型，其中以Ⅳ型為主\[10/31(32.26%)\]，其他型分布比較接近。在11株HVR-PCR分型的10DRUs型中RAPD Ⅳ型4株\[4/11(36.36%)\]，RAPD Ⅲ型和RAPD Ⅳ型各2株\[2/11(18.18%)\];10株RAPD Ⅳ型中9DRUs型、10DRUs型各4株\[4/10(40.00%)\]。結(jié)論RAPD方法和HVR-PCR方法對MRSA的分型率都比較高，而且這兩種方法都比較簡單、穩(wěn)定、可靠、快速，實用性強，具有廣闊的應用前景。
【關鍵詞】 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;MecA基因;隨機擴增多態(tài)性DNA;MecA基因相關高變區(qū)PCR擴增
ABSTRACT: ObjectiveTo investigate the polymorphisms of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in local hospitals in order to provide evidence for clinical doctors to use the antibiotics rationally and effectively.MethodsWe analyzed the polymorphisms of MRSA with themethods of PCR for mec-associated hypervariable region (HVR-PCR) and random amplifiedpolymorphic DNA (RAPD). MRSA strains typed by HVR-PCR according to the length polymorphisms which decided by the number of direct repeat unit elements (DRUs) of HVR-PCR products; Grouping of MRSA by RAPD was based on the dependability among different MRSA isolates.ResultsTotally 31 MRSA strains typed by HVR-PCR were divided into 7 types which contained 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 16 DRUs. MRSA strains with 10 DRUs were most predominant, present in 11/31 cases (35.48%). Among the 31 MRSA strains typed by HVR-PCR, only 1 showed 16 DRUs. There were 10 types classed by RAPD of all MRSA strains.The dominant type was RAPD Ⅳ, present in 10/31 cases (32.26%). The others showed similar distribution.ConclusionRAPD and HVR-PCR methods not also possess a good ability to obtain interpretable results, but also are simple, stable, reliable and rapid. They both have perfect practicality and prospect of extensive application.
KEY WORDS: methicillin-resistant Staphylococcus aureus; mecA gene; random amplified polymorphic DNA; PCR for the mec-associated hypervariable region
葡萄球菌的分型方法很多，傳統(tǒng)的分型方法包括血清學分型、抗生素分型等，但均無法滿足精確辨別的要求。分子生物學技術的出現(xiàn)為這一領域帶來了革命。目前，分子分型方法已成為研究細菌耐藥性發(fā)生及傳播的重要手段，常見的有：脈沖場凝膠電泳(pulsed-fiel gel electrophoresis, PFGE)，隨機擴增DNA多態(tài)性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)，mecA基因高變區(qū)長度多態(tài)性(PCR for the mec-associated hypervariable region, HVR-PCR)，熒光擴增片段長度多態(tài)性(fluorescent amplified fragment length polymorphrism, FAFLP)等。這些方法各有特點，應用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureu, MRSA)的分型在國內(nèi)外均有報道，但這些方法尚未成熟，各地分型標準也不一樣，且多采用單一的分型方法。RAPD 和HVR-PCR聯(lián)合應用于MRSA多態(tài)性分型尚未見報道。本實驗采用RAPD和HVR-PCR兩種方法對MRSA菌株進行分型，了解其多態(tài)性分布狀況、鑒別菌株之間的相關性，為合理、有效地使用抗生素和控制耐藥基因在種群間的傳播提供理論基礎。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1標本來源實驗用的31株MRSA標本來源于2007年3月至2007年12月間西安交通大學醫(yī)學院第一、第二附屬醫(yī)院的住院患者。
1.1.2實驗儀器及試劑MicroScan auto Scan-4型全自動細菌鑒定分析;藥敏試驗紙片購自英國OXOID公司，Mueller-Hinton平板由本實驗室自行配置;細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、PCR試劑2×Taq PCR MasterMix(含染料)、DNA Marker Ⅱ均購自北京TIANGEN生物技術有限公司;溶菌酶(活力單位>2000u/mg)、蛋白酶K購自Amrescos生物公司;金黃色葡萄球菌mecA基因PCR檢測引物和HVR-PCR、RAPD多態(tài)性分析引物，由北京奧科生物技術有限責任公司合成。DNA擴增儀為MJ Research Inc公司的PTC-200 PCR儀;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀為美國Bio-RAD公司產(chǎn)品;ZF紫外分析儀購自上海小源科技有限公司。
1.2方法
1.2.1細菌鑒定用MicroScan auto Scan-4型全自動細菌鑒定分析儀鑒定MRSA，同時用PCR檢測mecA基因，凡頭孢西丁(FOX，30μg)紙片藥敏試驗≤19mm的金黃色葡萄球菌，且mecA基因陽性者報甲氧西林耐藥，即為MRSA。
1.2.2PCR引物根據(jù)GenBank中金黃色葡萄球菌MRSA基因序列選取適用引物：HVR引物序列為，P1：5′-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3′，P2：5′-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3′[1]，RAPD引物序列為，EP007：5′-AGCACGCTGTCAATCATGTA-3′[2]，KAY1：5′-AGCAGCCTGC-3′[2]。
1.2.3細菌DNA的提取按北京TIANGEN公司生產(chǎn)的細菌基因提取試劑盒(DP302)步驟，提取葡萄球菌基因組DNA。
1.2.4MRSA的HVR-PCR分型取經(jīng)藥敏試驗和基因檢測為MRSA的菌株基因組DNA 1μL作為擴增的模板，加入PCR反應體系：HVR P1和P2引物各1μL(引物濃度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，滅菌去離子水ddH2O 9.5μL，反應總體積為25μL。PCR反應條件：94℃預變性5min;94℃ 60s，56℃ 45s，72℃，60s，35個循環(huán);72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后分析結(jié)果。
1.2.5MRSA的RAPD分型取經(jīng)藥敏試驗和基因檢測為MRSA的菌株基因組DNA 1μL作為擴增的模板，加入PCR反應體系：RAPD引物EP007 1μL(引物濃度10μmol/L)，RAPD引物KAY1 1μL(引物濃度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，滅菌去離子水ddH2O 9.5μL，反應總體積為25μL。PCR反應條件：94℃預變性2min;94℃ 45s，34℃ 45s，72℃，60s，35個循環(huán);72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中進行成像分析。
2結(jié)果
2.1MRSA的HVR-PCR分型結(jié)果應用HVR-PCR方法對31株MRSA標本進行分型，一共可以分為7型，分別含有7、8、9、10、11、12和16個DRUs。所有的MRSA都可以擴增出長度450～820bp的基因片段，用HVR-PCR分型方法都可以加以區(qū)分，分型率達到了100%。DRUs的數(shù)目=(擴增的基因片段長度-171)/40，其中171是存在于擴增序列之中而沒有重復的序列片段長度，40是每一個正向重復單元序列的長度。所有MRSA菌株中，10DRUs型最多(11/31，35.48%)，其次是9DRUs型(8/31，25.81%)，11DRUs型(4/31，12.90%)，7DRUs型(3/31，9.68%)，12DRUs型(2/31，6.45%)，8DRUs型(2/31，6.45%)，最少的是16DRUs型(1/31，3.23%)。
2.2MRSA的RAPD分型結(jié)果
2.2.1RAPD的電泳結(jié)果31株MRSA經(jīng)過RAPD兩條引物混合擴增分型，均可得到數(shù)量不等、位置不同的擴增條帶，條帶數(shù)目在1～6條之間，分型率達100%(圖2)。圖1MRSA的HVR-PCR電泳圖Fig.1 The electrophoresis result of HVR-PCR of MRSAM：100bp ladder DNA Marker;1、3、6、10： PCR產(chǎn)物長531bp，9DRUs型;2、7：PCR產(chǎn)物長571bp，10DRUs型;4、9：PCR產(chǎn)物長611bp，11DRUs型;5、8：PCR產(chǎn)物長651bp，12DRUs型。表1HVR-PCR的分型結(jié)果
2.2.2MRSA聚類分析結(jié)果根據(jù)RAPD電泳圖譜中條帶的數(shù)目及位置，經(jīng)NTSYS統(tǒng)計軟件進行聚類分析，得到遺傳距離樹狀圖。31株MRSA共分10型，其中以Ⅳ型為主(10/31，32.26%)，其他型分布比較接近。根據(jù)遺傳樹狀圖分布情況可知各菌株間遺傳性狀，其中RAPD Ⅱ型、Ⅲ型差異較小，均有4條帶;RAPD Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型遺傳性狀也比較接近，各有4條帶，但是條帶在位置上有所差別;RAPD Ⅸ型、Ⅹ型差異較小，Ⅸ型有2條帶，Ⅹ型只有1條帶。遺傳距離樹狀圖和RAPD分型結(jié)果見圖3。圖2RAPD的電泳圖Fig.2 The electrophoresis result of RAPD M：DNA Marker Ⅱ;1、2、3、5、9：RAPD Ⅳ型;4、6：RAPD Ⅵ型;7、8：RAPD Ⅹ型。
2.2.3RAPD與HVR-PCR對MRSA的聯(lián)合分型
應用RAPD與HVR-PCR對31株MRSA進行聯(lián)合分型，這兩種方法的分型率都比較高，都達到了100%。在11株HVR-PCR分型的10DRUs型中RAPD Ⅳ型4株(36.36%)，RAPD Ⅲ型和RAPD Ⅵ型各2株(18.18%);10株RAPD Ⅳ型中9DRUs型、10DRUs型各4株(40.00%)(表2)。表2RAPD與HVR-PCR對MRSA的聯(lián)合分型 圖331株MRSA的遺傳距離樹狀圖Fig.3 The genetic distance tree of 31 MRSAs橫坐標為相關系數(shù)，縱坐標為菌株編號。
3討論
根據(jù)HVR多態(tài)性，將31株MRSA分為7型，以10DRUs型多見，共11株(35.5%)，16DRUs型少見，只有1株(3.23%)。SENNA等[1]報道，根據(jù)HVR多態(tài)性將從巴西Porto Alegre地區(qū)分離的254株MRSA分為8型。本實驗未發(fā)現(xiàn)3DRUs型及5DRUs型，而多了16DRUs型，這可能與菌株數(shù)較少有關，也可能本地區(qū)無此型菌株存在，有待進一步研究。采用HVR-PCR 法對MRSA進行分型，與MRSA的表型分型法、藥敏試驗相結(jié)合，對于追蹤MRSA感染源、控制流行、指導臨床抗菌藥物的合理應用具有重要意義。
另外，MRSA中dru不同重復次數(shù)有何具體生物學意義，即片段大小不同對PBP2a構(gòu)型及其介導耐藥性高低的關系有何影響，國內(nèi)外尚無報道，有待進一步探討。SCHMITZ等[3]用PFGE、RAPD、16-23S rDNA、蛋白APCR、HVR-PCR、凝固酶基因PCR對183株MRSA分型，發(fā)現(xiàn)PFGE結(jié)果與HVR-PCR結(jié)果相近，對MRSA都有比較高的區(qū)分能力。WICHELHAUS等[4]同時應用凝固酶基因多態(tài)性、spa基因多態(tài)性，mecA基因高變區(qū)長度多態(tài)性及PFGE對46株MRSA進行分子分型研究，證實了這3種特異功能集團的多態(tài)性分型方法與PFGE分型一致，適合于短時間如幾天到幾周內(nèi)的流行病學分析，12h可出結(jié)果，而PFGE則需5d或更長時間。雖然HVR-PCR沒有PFGE對MRSA分型效果好，但是比凝固酶基因PCR更能有效地對MRSA分型，而且分型率比較高，對其流行病學研究有重要的意義[5]。mecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌所特有，而HVR基因高變區(qū)與該基因緊密相連，存在于其下游，也具有特異性。HVR-PCR法操作簡單、快速，不需要特殊的電泳設備和限制酶消化，大多數(shù)的臨床微生物實驗室皆可進行。
本實驗在藥敏試驗的基礎上采用雙引物RAPD法對31株MRSA進行了基因分型，根據(jù)RAPD電泳圖譜中條帶的數(shù)目及位置，經(jīng)NTSYS統(tǒng)計軟件進行聚類分析，得到遺傳樹狀圖。31株MRSA共分為10個基因型。韓立中等[6]用RAPD法將檢測菌株分為4個型別(A～D型)，分型區(qū)別較大的原因可能是RAPD引物選擇的不同，另外由于使用隨機的引物，一旦基因組DNA分子發(fā)生片段插入、缺失或堿基突變，將造成引物特定結(jié)合位點的變化，使PCR擴增產(chǎn)物的條帶發(fā)生分子量和數(shù)目的改變。WILLEM等[7]在美國紐約市立醫(yī)院及紐約疾病控制中心共收集103株金黃色葡萄球菌，用RAPD分型方法共檢測出71株MRSA，檢出率高達69%，其中52株被認為與醫(yī)院和社區(qū)感染有關，其他19株同源性相差較遠，被認為是流行病學無關株。VAN BELKUM等[8]曾用3種RAPD引物(RAPD1、RAPD7和ERIC2)對金黃色葡萄球菌分型，并同PFGE作比較，證實RAPD是金葡菌基因分析以及監(jiān)測醫(yī)院感染流行較理想的分型手段。RAPD的特異性好、分析周期短、簡易、穩(wěn)定、可靠、不需要特殊試劑和生物材料，適用于所有生物的分型，尤其是對一些尚未建立標準分型方法和缺乏血清型等方法的菌屬(種)的鑒定和分型特別實用。美國醫(yī)院流行病學協(xié)會已推薦該方法為醫(yī)院感染中常見病原菌的分型方法[9]。因此，RAPD技術在傳染病學、微生物流行病學和醫(yī)院內(nèi)感染學領域有很好的應用前景。
在MRSA的流行病學研究中，往往會把幾種方法聯(lián)合使用，這樣對MRSA的流行病學分析往往會更加準確。李家泰等[10]采用HVR-PCR基因型和腸毒素基因型相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)兩種基因型結(jié)合起來有助于提高MRSA分型的可靠性。本實驗將RAPD方法與HVR-PCR方法相結(jié)合，以藥物敏感實驗為基礎，對臨床分離的MRSA做流行病學分析。RAPD方法和HVR-PCR方法對MRSA的分型率都比較高，都達到了100%，而且這兩種方法都比較簡單、穩(wěn)定、可靠、快速，可以在短時間內(nèi)對MRSA進行分型。研究中還發(fā)現(xiàn)這兩種方法之間沒有很好的相關性，即相同的RAPD型可以表現(xiàn)出不同的HVR-PCR型;反之，相同的HVR-PCR型也可以呈現(xiàn)出不同的RAPD型。
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