從噬菌體表面展示環(huán)狀7肽肽庫(kù)中篩選葡萄球菌B型腸毒素抑制劑

作者：李韓平，周宏，鄭玉玲，鄧小紅，馬茹，姜永強(qiáng)
【關(guān)鍵詞】 葡萄球菌B型腸毒素
Screening inhibitor of Staphylococcal enterotoxin B from random circular 7mer peptide library displayed on phage
　　【Abstract】 AIM: To obtain the specific peptide which can bind with SEB and inhibit SEBs enterotoxin activity by panning from the random circular 7mer polypeptide libraries. METHODS: The affinity of peptide and the competitive activity of the synthetic peptide with that of antiSEB monoclonal antibody (McAb) were detected respectively by PhageELISA and competition ELISA. Animal experiment was performed to assess the suppressive effect of the screened peptide on the toxicity of SEB and its enterotoxin. RESULTS: The circular 7mer peptide obtained by panning suppressed the multiplication of spleen lymphocytes in mice. At the ratio of 160:1 (SEB: synthetic 7mers peptide), the peptide protected the little cats from attack of enterotoxin and the survival rate of mice treated with the screened peptide was significantly higher compared with that of the control group. CONCLUSION: The obtained peptide specifically combines with SEB and suppresses its enterotoxin activity, which paves the way for the development of SEB inhibitors.
　　【Keywords】 staphylococcal enterotoxin B; peptide library; screening; inhibitor
　　【摘要】 目的： 擬通過生物淘選從噬菌體表面展示環(huán)狀7肽肽庫(kù)中篩選出與葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)結(jié)合并能抑制該毒素毒性效應(yīng)的特異性短肽. 方法： 采用PhageELISA來鑒定所得目的肽的親和性；利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA研究合成肽與SEB mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SEB的情況；通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察其抑制SEB的超抗原特性和腸毒活性情況. 結(jié)果： 篩選所得短肽在一定濃度范圍內(nèi)可以抑制SEB對(duì)鼠脾淋巴細(xì)胞的激活；合成肽與SEB質(zhì)量比160∶1下，合成肽可較好地抑制SEB對(duì)乳貓的腸毒活性，并對(duì)SEB引起的小鼠致死具有明顯保護(hù)作用. 結(jié)論： 得到了能與SEB特異結(jié)合并能抑制SEB超抗原特性和腸毒活性的短肽.
　　【關(guān)鍵詞】 葡萄球菌B型腸毒素；肽庫(kù);篩選;抑制劑
　　0引言
　　
　　葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)［1］是超抗原(SAg)家族的主要成員之一，該毒素可以造成食物中毒，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致致死性休克. SEB中毒后缺乏特異的治療手段，因此研究SEB的特異高效抑制劑具有重大的意義. 我們利用固相篩選方法，即以SEB作為親和靶標(biāo)蛋白，從環(huán)狀7mer肽噬菌體文庫(kù)中篩選到與SEB結(jié)合，并能抑制該毒素毒性效應(yīng)的噬菌體克隆. 結(jié)果表明，所篩選環(huán)狀7mer肽在細(xì)胞水平上可抑制SEB對(duì)小鼠脾細(xì)胞的激活，在整體動(dòng)物水平上對(duì)SEB導(dǎo)致的毒性具有一定保護(hù)作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　環(huán)狀7mer肽噬菌體文庫(kù)( Random circular 7mers peptide library displayed on phage)為New England BioLabsInc產(chǎn)品; M13噬菌體單鏈DNA提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品； SEB單克隆抗體由本室保存; DGal(D半乳糖)為Sigma產(chǎn)品；抗M13噬菌體mAb、CM Sepharose FF為Amesham產(chǎn)品; BCA蛋白定量試劑為Pierce產(chǎn)品.乳貓BALB/C實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院豐臺(tái)實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng).
　　1.2方法
　　隨機(jī)肽庫(kù)的擴(kuò)增、定量按照所附試劑盒說明書進(jìn)行；純化按QIAprepM13 Handbook進(jìn)行. 親和靶標(biāo)蛋白SEB的分離純化與定量按文獻(xiàn)［2］方法進(jìn)行. 依據(jù)優(yōu)勢(shì)噬菌體陽(yáng)性克隆序列合成相應(yīng)的多肽,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院六所合成, 并進(jìn)行了多肽純化和脫鹽處理,合成多肽的純度達(dá)95%以上. 將純化的SEB與0.1 mol/L NaHCO3(pH 8.6)相混合, 制成質(zhì)量濃度為1 g/ L的溶液,取100 μL混合液加于酶聯(lián)條微孔進(jìn)行包板固定，于4℃過夜；次日棄包被液后，加200 μL濃度為 50 g/L BSA于酶聯(lián)孔中進(jìn)行封閉，37℃結(jié)合2 h,間隙振蕩；棄封閉液，取100 mL/L TBST液200 μL洗滌6次,間隔為5 min/次,然后將10 μL肽庫(kù)原液加于含有100 μL TBST的酶聯(lián)孔中,室溫輕搖過夜;次日棄未結(jié)合的噬菌體,取100 ml/L TBST 200μL洗滌10次,間隔為3 min/次,最后加80 μL洗脫緩沖液,室溫輕柔吹打10 min后,將洗脫得到的噬菌體轉(zhuǎn)入微量離心管中,立即加入15 μL 1 mol/L TrisHCL(pH 9.1)進(jìn)行中和. 將所得噬菌體進(jìn)行感染、擴(kuò)增、純化后進(jìn)行下一輪篩選. 在后續(xù)的篩選中TBST的濃度增為500 mL/L. 隨機(jī)挑取第3輪噬菌體單克隆進(jìn)行培養(yǎng)后進(jìn)行PhageELISA分析及DNA序列測(cè)定. 將SEB包被酶聯(lián)板，經(jīng)30 g/L BSA封閉后加入培養(yǎng)好的單克隆上清，采用PhageELISA法檢測(cè)SEB與噬菌體的結(jié)合情況. ssDNA的提取

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