葛根芩連湯上清液與沉淀中異黃酮類成分指紋圖譜的研究

【關(guān)鍵詞】葛根芩連湯；,,指紋圖譜；,,上清液；,,沉淀

　　摘要：目的通過應(yīng)用三維高效液相色譜，建立葛根芩連湯上清液和沉淀中異黃酮指紋圖譜的方法，明確其上清液和沉淀中異黃酮類成分的異同，以便進一步探討該方的配伍規(guī)律。方法葛根素、大豆苷元用甲醇溶解制成對照品溶液，葛根藥材水煎液、葛根芩連湯上清液、沉淀用二甲基亞砜溶解制成供試品溶液，采用三維高效液相譜對葛根芩連制劑進行指紋圖譜實驗研究，流動相為甲醇水乙腈梯度洗脫，掃描波長為200～400nm。結(jié)果在梯度洗脫條件下，葛根芩連湯上清液的HPLC指紋圖譜中有6個標(biāo)識性共有峰，葛根芩連湯沉淀的HPLC指紋圖譜中有4個標(biāo)識性共有峰。但峰面積僅占上清液的8%（以葛根素計）。結(jié)論葛根芩連湯配伍產(chǎn)生的沉淀中亦有異黃酮類有效部位，但與上清液比較，含量較低。說明君藥葛根中異黃酮類成分與方劑中的其他物質(zhì)絡(luò)合而產(chǎn)生沉淀，且該沉淀溶于二甲基亞砜。

　　關(guān)鍵詞：葛根芩連湯；指紋圖譜；上清液；沉淀

　　葛根芩連湯原載于東漢張仲景《傷寒論》中，由葛根、黃芩、黃連、炙甘草4味中藥組成。其處方為：葛根15g，黃芩9g，黃連9g，甘草(炙)6g。其中葛根為君藥，黃芩、黃連為臣藥，炙甘草為使藥。功效主要是表里雙解，清熱止痢。中藥配伍在煎煮過程中，其成分發(fā)生復(fù)雜的變化，其中沉淀反應(yīng)是中藥配伍共煎時常見的變化。日本學(xué)者于1978年首次報道黃連配伍甘草、大黃時小檗堿等生物堿在煎劑中的含量大幅度下降［1］。其沉淀能溶于二甲基亞砜，部分溶于吡啶、稀酸、稀堿，微溶于冷甲醇、乙醇，不溶于氯仿、石油醚、在熱甲醇中能不斷溶解，冷后又生成沉淀［2］。沉淀使煎液中有效成分的含量降低，且有研究表明，黃連黃芩配伍產(chǎn)生的沉淀，能夠在胃腸內(nèi)溶解［3］，但葛根芩連湯配伍后究竟是哪些成分發(fā)生沉淀反應(yīng)，目前尚未有明確的結(jié)論。本實驗試圖通過指紋圖譜的方法，探明其上清液與沉淀中異黃酮成分的異同，以明確沉淀物中是否有異黃酮類成分。

　　1儀器與試藥　

　　美國惠普HP1100高效液相色譜儀，G1315A紫外可見光二級管陣列檢測器，離心機（北京醫(yī)用離心機廠），甲醇(分析純，天津大茂學(xué)試劑廠)、甲醇（色譜純，MERCK)，乙腈(色譜純)，葛根素對照品753200007、大豆苷元對照品1502200101(中國藥品生物制品檢定所)；葛根、黃芩、黃連、甘草藥材由廣東省致信藥材公司提供,經(jīng)本校中藥鑒定教研室劉傳明講師鑒定,分別為豆科植物野葛PuerarialobataOhwi,唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi干燥根莖,毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.干燥根莖,豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.干燥根莖(蜜炙)。

　　2方法

　　2.1葛根芩連湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶劑的制備葛根15g，黃芩9g，黃連9g，甘草6g，燒杯中加水400ml,先煎葛根20min,余藥共煎30min,煎兩次,趁熱120目濾布濾過,合并濾液。90℃定容至1000ml,靜置室溫后，于冰箱4℃內(nèi)靜置24h，取出，離心以3000r/min，得到上清液，定容到1000ml，為供試品溶液1；沉淀于烘箱內(nèi)50℃干燥24h后，加適量二甲基亞砜使溶解，定容到1000ml，過濾，得供試品溶液2。

　　2.2色譜條件甲醇∶水∶乙腈梯度洗脫［4，5］檢測波長的選擇。結(jié)果見表1。依據(jù)DAD檢測的三維圖譜,選擇可將全譜物質(zhì)均能檢測到的250nm作為最后的檢測波長(圖1～3)。

　　表1梯度洗脫條件（略）

　　圖1葛根藥材水煎液（略）

　　圖2葛根全方上清液（略）

　　圖3葛根芩連全方沉淀（略）

　　2.3對照溶液的制備

　　2.3.1對照藥材溶液的制備取葛根藥材15.09g，水煎煮2次，煎煮時間分別為30，20min，濾過，煎煮液定容到1000ml，即得。

　　2.3.2對照品溶液的制備精密稱取葛根素、大豆苷元各5mg，于50ml容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，即得。 論文網(wǎng)在線

　　2.4樣品測定精密吸取各溶液10μl，注入高效液相色譜儀（HPLC）中，參照高效液相色譜法，結(jié)合指紋圖譜的要求進行實驗，以對照藥材為參照色譜，測定并記錄色譜圖，以中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版采用多點校正的方法進行計算分析。

　　2.5對照實驗吸取對照品溶液10μl，注入HPLC，得知21.5min左右的峰為葛根素，40min左右為大豆苷元。

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