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外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測在前列腺癌診斷中的臨床應(yīng)用

時間:2023-03-19 13:27:55 藥學(xué)畢業(yè)論文 我要投稿
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外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測在前列腺癌診斷中的臨床應(yīng)用

作者:辛華 馬雷 高英英 郭宇航 孫玉鴻 江清林 劉國輝
【摘要】 目的 探討利用外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測診斷前列腺癌(PCa)的臨床應(yīng)用及意義。方法 運用酶聯(lián)免疫分析和巢式RT?PCR檢測22例PCa、10例良性前列腺增生(BPH)患者,5例健康男性和5例健康女性外周血中PSA、PSA mRNA的情況。結(jié)果 PCa患者血清PSA的水平與臨床分期、Gleason評分有關(guān)(P<0?05),而與年齡無關(guān)(P>0?05);外周血PSA、PSA mRNA與臨床分期、內(nèi)分泌治療有關(guān)(P<0?05),而與年齡、Gleason評分無關(guān)(P<0?05);22例PCa標(biāo)本中PSA mRNA陽性表達(dá)15例,陽性率68%,10例BPH和10例陰性對照標(biāo)本無表達(dá)。結(jié)論 利用外周血PSA、PSA mRNA聯(lián)合檢測是一種早期發(fā)現(xiàn)PCa微轉(zhuǎn)移,判斷其臨床變化過程、分期、預(yù)計復(fù)發(fā)和評價療效的方法。
【關(guān)鍵詞】 前列腺特異抗原;前列腺癌;前列腺增生;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
  臨床上大約有50%的前列腺癌(PCa)病人在確診時就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移,病變已屬晚期,預(yù)后不良〔1~3〕。國外報道血清游離PSA與外周血PSA mRNA聯(lián)合檢測PCa在鑒別良、惡疾病上有一定優(yōu)越性〔4,5〕。國內(nèi)這方面報道較少。應(yīng)用RT?PCR技術(shù)檢測外周血中存在的少量癌細(xì)胞,可以發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移,對腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后及臨床治療具有指導(dǎo)意義〔6,7〕。本研究采用酶聯(lián)免疫技術(shù)和巢式RT?PCR技術(shù)聯(lián)合檢測外周血PSA和PSA mRNA,以提高PCa微轉(zhuǎn)移的診斷效率、監(jiān)測復(fù)發(fā)、預(yù)測腫瘤分期及預(yù)后。
  1 材料與方法
  1?1 病例資料
  PCa組:選擇2005~2006年佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院、佳木斯市中心醫(yī)院門診和住院病人。22例均為初診PCa患者,均經(jīng)前列腺穿刺病理診斷,年齡64~82歲,平均72歲。22例PCa患者中有15例接受了內(nèi)分泌治療,7例未接受。BPH組:10例均為行前列腺經(jīng)尿道電切術(shù)后病理證實患者,年齡34~81歲,平均65歲。陰性對照組:5例男性健康志愿者(檢測前1個月限制性生活)和5例女性健康志愿者,血液學(xué)指標(biāo)均正常,年齡25~45歲,平均38歲。
  1?2 儀器及材料

  Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所,總RNA提取RNAiso試劑盒、兩步法RT?PCR試劑盒購自大連生物工程有限公司,引物由上海生物工程服務(wù)技術(shù)有限公司合成,PSA定量試劑盒購自美國博檢生物試劑有限公司。Biometra Tg PCR 儀:華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司;DU800核酸蛋白分析儀:Beckman公司;免疫分析儀器:DNM9602G型酶標(biāo)分析儀(北京普朗儀器公司)。
  1?3 引物序列

  PCR引物:(1)外引物:PSA?494:5’?TACCCACTGCATCAGGAACA?3’;PSA?960:5’?CCTTGAAGCACACCATTACA?3’。(2)內(nèi)引物:PSA?559:5’?ACACAGGCCAGGTATTTCAG?3’;PSA?894:5’?GTCCAGCGTCCAGCACACAG?3’。β?actin 上游:5’?CGGGAAATCGTGCGTGACAT?3’;下游:5’?GAACTTTGGGGGATGCTCGC?3’。擴(kuò)增目的片段長度為712 bp。
  1?4 血清的提取

  抽取空腹靜脈血(各項檢查前)5 ml,立即2 000 r/min離心10 min,分離血清置-20℃保存,1 w內(nèi)完成實驗。
  1?5 外周血單個核細(xì)胞的提取
  抽取5 ml靜脈血(各項檢查前)肝素抗凝,用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞置-80℃冰箱保存,提取過程按其說明書操作。
  1?6 總RNA的抽提及質(zhì)量鑒定
  用Trizal試劑提取總RNA,提取過程按其說明書操作。提取產(chǎn)物用1?2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。紫外分光光度計下測OD260、OD280,測定RNA純度和濃度。取OD260/OD280值在1?8~2?0范圍內(nèi)的標(biāo)本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所有實驗中的塑料制品及實驗用具均經(jīng)0?1轕C水處理后高壓滅菌。
  1?7 RT?PCR
  取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl和PSA上下游外、內(nèi)引物各1 μl,使用20 μl反應(yīng)體系進(jìn)行2次PCR(2次PCR反應(yīng)體系相同),同時擴(kuò)增PSA、β?actin和陰性對照cDNA(由健康女性外周血白細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得)。具體循環(huán)參數(shù)為:94℃ 4 min,94℃ 45 s,55℃ 30 s,72℃ 45 s;25個循環(huán)之后,72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用EB染色,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。
  1?8 血清PSA的檢測
  PSA定量檢測由專人嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。
  1?9 統(tǒng)計學(xué)處理
  應(yīng)用SPSS10?0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用t檢驗、χ2檢驗。
  2 結(jié)果
  2?1 PCa組、BPH組、陰性對照組血清PSA檢測結(jié)果 見表1。表1 PCa組、BPH組、陰性對照組血清PSA的檢測結(jié)果(略)
  2?2 PCa組血清PSA檢測結(jié)果與臨床參數(shù)的關(guān)系
  見表2。表2 PCa組血清PSA與

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