前列腺癌中基質(zhì)金屬蛋白酶7，9的表達(dá)及其與VEGF的關(guān)系

作者：周洪瀾 邢春偉 葛巖 王心蕊 王醫(yī)術(shù)
【摘要】 目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶7，9在前列腺癌轉(zhuǎn)移侵襲中的作用，以及VEGF與基質(zhì)金屬蛋白酶的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學(xué)和形態(tài)定量分析方法分析MMP7及MMP9表達(dá)情況，同時(shí)培養(yǎng)PC3M細(xì)胞并采用Boyden小室侵襲試驗(yàn)及酶譜分析觀察MMP9及其與VEGF在前列腺癌中的作用。結(jié)果 前列腺癌各分級中MMP7和MMP9的表達(dá)均有顯著性差異(P＜0?001)。Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，不同試驗(yàn)組穿透Matrigel的細(xì)胞數(shù)依次遞減，即PC3M＞ PC3M MMP9Ab (1∶100)＞ PC3M MMP9Ab (1∶50)，均有顯坐的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0?01)。酶譜分析觀察發(fā)現(xiàn)，直接培養(yǎng)于培養(yǎng)皿表面的PC3M 細(xì)胞僅有穩(wěn)定的MMP?9和MMP?2酶原表達(dá)，但PC3M細(xì)胞與VEGF共孵育組條件培養(yǎng)基中MMP?9酶原含量以VEGF劑量依賴的方式增加。結(jié)論 MMP7和MMP9可作為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的判定指標(biāo)。VEGF與MMPs的分泌有關(guān)，其機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。
【關(guān)鍵詞】 前列腺癌；基質(zhì)金屬蛋白酶；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子
　　基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）生物學(xué)效應(yīng)貫穿于腫瘤發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)〔1，2〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作為一種與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的生長因子，可通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)放大效應(yīng)而調(diào)節(jié)MMPs的產(chǎn)生與活化〔3，4〕，使得細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）處于不斷地合成與分解代謝的動態(tài)平衡中，這種動態(tài)平衡的穩(wěn)定是維持組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重要基礎(chǔ)。本研究以前列腺癌作為研究對象，探討前列腺癌中金屬蛋白酶與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的關(guān)系，以及金屬蛋白酶和VEGF的關(guān)系。
　　1 材料與方法
　　1?1 材料
　　所有前列腺癌材料取自手術(shù)切除的新鮮組織，共計(jì)34例，其中5例Gleason Grade 2，9例Gleason Grade 3,14例Gleason Grade 4，6例Gleason Grade5。5例正常前列腺組織取自意外死亡的正常男性青年。所有標(biāo)本均經(jīng)嚴(yán)格篩選并經(jīng)病理診斷證實(shí)。體外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞PC3M由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室惠贈；NIH3T3細(xì)胞由吉林大學(xué)第三臨床學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈。
　　1?2 免疫組織化學(xué)染色
　　免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉素抗生物素蛋白?過氧化物酶連接法（SP法）。所用一抗(MMP7，9，13)、二抗、三抗及DAB均購自邁新公司。步驟如下：梯度脫水、脫蠟，過氧化物酶(A液)阻斷15 min，非免疫動物血清(B液)封閉；加入一抗，4℃過夜后；加生物素標(biāo)記二抗(C液)30 min，滴加鏈親和素?過氧化物酶溶液(D液)30 min；DAB發(fā)色，水洗終止；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。
　　1?3 形態(tài)定量方法
　　通過Cooled CCD采集預(yù)計(jì)數(shù)視野圖片，而后采用Image?Pro Plus Analysis Software分析表達(dá)陽性的切片。
　　1?4 細(xì)胞培養(yǎng)
　　在含10%新生牛血清和抗生素的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC3M。
　　1?5 Boyden小室腫瘤侵襲試驗(yàn)
　　NIH3T3條件培養(yǎng)液的制備：鋪Matrigel基膜膠，收集前列腺癌細(xì)胞，向小室上室內(nèi)加入100 μl癌細(xì)胞懸液，于37℃，5%CO2條件下孵育4～6 h，醋酸?酒精?甲醛固定液固定20 min，HE染色，中性樹膠封片。侵襲細(xì)胞的計(jì)數(shù)：在400×視野下任取10個(gè)不重復(fù)視野，利用目鏡測微尺計(jì)數(shù)每個(gè)視野穿透Matrigel基膜膠下室面的腫瘤細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算平均值。
　　1?6 酶譜分析
　　酶譜分析基本步驟：配制含1 mg/ml明膠的10%SDS?PAGE底物；將已制好的濃縮蛋白樣品不經(jīng)加熱直接上樣；以5 mA/gel電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，將電泳電流提高到10 mA/gel；電泳完成后，將底物膠置于孵育緩沖液中37℃緩慢搖擺18 h，以使待測MMPs充分作用于底物；孵育結(jié)束后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色30 min及脫色液（45%甲醇，10%冰乙酸）脫色60 min，觀察結(jié)果。利用圖像分析軟件對酶譜分析結(jié)果進(jìn)行灰度掃描。利用紫外分光光度法測蛋白質(zhì)含量，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行樣本，組織酶譜分析重復(fù)多次觀察。具體步驟：電泳、封膠后，利用圖像分析程序，讀取圖像反轉(zhuǎn)膜式后各消化條帶的灰色度及面積，計(jì)算各條帶的酶含量。酶含量=條帶面積×（條帶灰度減于背景灰度），將所得值再換算成單位蛋白表達(dá)量作為最終測得的酶含量值，從而對各組細(xì)胞的酶活性進(jìn)行定量比較。
　　1?7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　所有統(tǒng)計(jì)均由INSTAT統(tǒng)計(jì)軟件包完成。兩組間均數(shù)采用t檢驗(yàn)。
　　2 結(jié)果
　　2?1前列腺癌中MMP7和MMP9的表達(dá)
　　5例正常前列腺組織中，MMP7和MMP9均為3例陽性表達(dá)和2例陰性表達(dá)。前列腺癌中MMP7和MMP9均陽性表達(dá)，其蛋白均主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞漿或胞膜中，部分間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞也呈陽性表達(dá)（圖1），MMP7灰度值為32 047 930±9 499 987，MMP9灰度值為23 873 011±14 414 601。前列腺癌各分級中MMP7和MMP9的表達(dá)均有顯著性差異(P＜0?001)（圖1）。
　　2?2 Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)
　　在Boyden小室的上室內(nèi)分別加入前列腺癌細(xì)胞PC3M，PC3M MMP9Ab (1∶100)，PC3M MMP9Ab (1∶50)，結(jié)果顯示，穿透Matrigel的細(xì)胞數(shù)依次遞減，即PC3M＞ PC3M MMP9Ab (1∶100)＞ PC3M M

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