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益氣消積方含藥血清對人胃癌NKN?28細胞株的作用
【關鍵詞】 胃癌; 血清; 腫瘤; 大鼠益氣消積方（Yiqi Xiaoji Recipe, YQXJR）是根據(jù)上海交通大學醫(yī)學院瑞金醫(yī)院中醫(yī)科主任沈小珩教授十多年致力于腫瘤研究的臨床經(jīng)驗，并結合臨床實踐總結而出的新一代抗癌復方，臨床觀察對胃癌有較好的治療作用。本次實驗采用益氣消積方含藥血清，溫育體外培養(yǎng)的人胃癌NKN?28細胞，通過甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法檢測細胞增殖抑制作用，研究該方對體外培養(yǎng)的人胃癌NKN?28細胞生長的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗材料 SD大鼠50只，雄性，清潔級動物，體質(zhì)量（250±30）g，由上海交通大學醫(yī)學院瑞金醫(yī)院動物房提供；人胃癌高分化腺癌細胞系NKN?28細胞，由上海瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室負責孵育提供；益氣消積方主要由黃芪、全蝎和白花蛇舌草等組成，生藥購自上海瑞金醫(yī)院中藥房，由中藥房代煎，上海中藥研究所實驗室濃縮而成，含生藥量為2.8 g/ml；RPMI?1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶為Gibco公司分裝,批號31800?022；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品；MTT，上海實生細胞生物技術有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO），美國Fisher科學世界公司香港分公司產(chǎn)品；TE2000?U多功能倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品；MK3酶標儀，芬蘭雷勃公司產(chǎn)品。
1.2 益氣消積方含藥血清的制備
1.2.1 含藥血清的制備 選用正常SD大鼠36只，禁食12 h后，予益氣消積方煎液灌胃給藥。大鼠分為3個劑量組（每組12只）分別給藥，給藥劑量分別為，低劑量組1.17 g/kg，中劑量組5.85 g/kg，高劑量組11.7 g/kg，分別相當于60 kg成日用量的同倍、5倍、10倍。給藥方式為每天分2次給藥，即采用一次及二次重復（2 h后相同劑量重復給藥一次）給藥方法。連續(xù)灌胃3 d，第3天第1次給藥2 h后再給藥1次，1 h后，乙醚麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，靜置2 h以上，1 500 r/min，離心15 min，10 min后取血清，按灌胃濃度分別混合，56 ℃，30 min滅活，分裝，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。
1.2.2 大鼠正常血清制備 對照組SD大鼠14只用生理鹽水灌胃，每只2 ml/次，2次/d，連續(xù)3 d。于第3天第1次灌胃2 h后再灌胃1次，1 h后，乙醚麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，靜置2 h以上，1 500 r/min，離心15 min，10 min后取血清，56 ℃，30 min滅活，分裝，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?BR> 1.3 細胞培養(yǎng) NKN?28細胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基（含硫酸慶大霉素0.025 U/ml）中，于37 ℃、5％ CO2孵育箱中進行連續(xù)培養(yǎng)［2］。
1.4 倒置顯微鏡下細胞生長狀態(tài)觀察 上述培養(yǎng)細胞，去掉培養(yǎng)液，分別加入以上各組血清，在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，將培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下作生長狀態(tài)觀察。
1.5 細胞抑制率的檢測 取濃度為1×105個/ml處于對數(shù)生長期貼壁生長的人胃癌NKN?28細胞，按1×104個細胞/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板（200 μl/孔），放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，吸棄培養(yǎng)板上清后加入高、中、低濃度含藥血清及空白血清，每種濃度設1/2、1/4、1/8、1/16四種不同比例，200 μl/孔，每種比例設6個復孔。放回培養(yǎng)箱中，使藥物與細胞共同孵育48 h和72 h。取出培養(yǎng)板，向每孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)上清，每孔加入DMSO 150 μl，再放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，使結晶物充分溶解之后，在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處讀取各孔光密度值（即OD值）。抑瘤率（％）=（1－OD實驗組/OD對照組）×100［3］。
1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s表示，組間比較用單因素方差分析和LSD檢驗。
2 結果
2.1 人胃癌NKN?28細胞生長狀況 倒置顯微鏡下，對照組的人胃癌NKN?28細胞可見貼壁生長，細胞形態(tài)呈梭形，胞漿均勻，細胞透明，相鄰細胞生長融合成片；而經(jīng)含藥血清處理的各組細胞，24 h可見細胞由貼壁而脫落，至48 h脫落更明顯，脫落細胞懸浮于培養(yǎng)液中，細胞形態(tài)變圓或不規(guī)則，細胞變暗。比較含藥血清各組細胞生長狀況，以高劑量組含藥血清組作用48 h脫落最明顯。說明益氣消積方有抑制人胃癌NKN?28細胞生長的作用，呈現(xiàn)一定的時間濃度依賴性。
2.2 MTT檢測結果
2.2.1 48 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤作用 經(jīng)單因素方差分析，四組48 h不同濃度不同比例含藥血清對人胃癌NKN?28細胞的抑瘤率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。經(jīng)LSD組間檢驗，在1/2、1/4血清比例時，高、中劑量組的抑瘤率均明顯高于空白血清組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），低劑量組的抑瘤率略高于空白血清組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在1/8血清比例時，高劑量組的抑瘤率高于空白血清組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），中、低劑量組的抑瘤率略高于空白血清組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在1/16血清比例時，高、中、低三個劑量組的抑瘤率略高于空白血清組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。同時1/2、1/4、1/8血清比例時，高劑量的抑瘤率明顯高于各低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；1/16血清比例時，高劑量的抑瘤率略高于各低劑量組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明益氣消積方有抑制人胃癌NKN?28細胞增殖的作用，其抑制作用以高劑量組最佳。見表1。
2.2.2 72 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤率 經(jīng)單因素方差分析，四組72 h不同濃度不同比例含藥血清對人胃癌NKN?28細胞的抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。經(jīng)LSD組間檢驗，在各血清比例時，高劑量組的抑制率均高于空白血清組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在1/2、1/4血清比例時，中劑量組的抑制率高于空白血清組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；在1/2血清比例時，低劑量組抑瘤率高于空白血清組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在各血清比例時，高劑量組的抑瘤率均高于各低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明益氣消積方有抑制人胃癌NKN?28細胞增殖的作用，且這種抑制作用隨著中藥濃度及時間的增加而有所提高。見表2。
表1 48 h不同濃度不同比例含藥血清的抑瘤率（略）
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