研究青天葵活性部位的體外抗腫瘤作用

摘要：目的確定廣西特產(chǎn)藥材青天葵體外抗腫瘤作用的活性部位。方法青天葵部位提取物的制備主要采用溶劑法, 青天葵全草先用95%的乙醇提取，得到的提取物進(jìn)一步用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇依次提取，得到極性由小到大的4個(gè)提取部位�；钚院Y選采用MTT法實(shí)驗(yàn)，觀察青天葵提取物對7種腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有一定的體外抗腫瘤作用。結(jié)論首次確定了青天葵的石油醚和醋酸乙酯部分是體外抗腫瘤作用的有效部位。

關(guān)鍵詞： 青天葵 體外抗腫瘤作用 活性部位
　
　　青天葵為蘭科Orchidaceae植物毛唇芋蘭Nervilia
foadii(Hance) Schltr.的干燥全草，入藥始載于《嶺南采藥錄》，主要產(chǎn)于我國的廣西、廣東、海南，四川、云南，泰國也有分布，是廣西特產(chǎn)藥材［1～3］，具有清肺止咳、健脾消積、鎮(zhèn)痛止痛、散淤消腫、清熱解毒之功效，主治肺癆、咳嗽咳血、中毒、跌打損傷、小兒疳積、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等癥。近來還用含有青天葵的復(fù)方制劑治療鼻咽癌以緩解癥狀［4］，但未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外對其抗腫瘤有效成分及藥理作用的研究。為此，筆者對青天葵的干燥全草進(jìn)行了藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，對青天葵的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、甲醇4個(gè)不同部位采用體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初篩，為闡明青天葵的抗腫瘤作用并篩選出有效部位打下基礎(chǔ)�，F(xiàn)報(bào)道如下。
　　1 材料與儀器
　　1.1 受試樣品
　　藥材青天葵來源于南寧藥材站，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院劉壽養(yǎng)副教授鑒定為蘭科Orchidaceae植物毛唇芋蘭Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草。對青天葵的干燥全草進(jìn)行提取分離得4個(gè)部位：石油醚提取物（A）、醋酸乙酯提取物（B）、正丁醇提取物（C）、乙醇提取物（D）。A，B，C和D均用含有DMSO的培養(yǎng)液溶解，均配成濃度為480 μg/ml的溶液，置于-20℃冰箱密閉避光保存。臨用前用不含血清和抗生素的RPMI1640（NG108-15用DMEM）液稀釋至所需濃度，DMSO終濃度在0.01%水平。
　　1.2 培養(yǎng)液
　　1.2.1 RPMI完全培養(yǎng)液含RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO）、3%谷氨酰胺、卡那霉素750 μg/ml、10% FBS（臨用前加）。
　　1.2.2 DMEM完全培養(yǎng)液含DMEM培養(yǎng)基（GIBCO）、卡那霉素750μg/ml、10鸖（臨用前加）。
　　1.3 細(xì)胞株 白血病細(xì)胞株L1210和P388D1、宮頸癌細(xì)胞株Hela、人胃癌細(xì)胞株SGC7901、黑色素瘤細(xì)胞株B16、神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株NG108-15等均購自上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫，人肝癌細(xì)胞株Hela7404由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供。
　　1.4 試劑
　　MTT（四甲基噻唑藍(lán)）為德國Sigma公司產(chǎn)品，批號020609；FBS（胚胎牛血清）為美國Hyclone公司產(chǎn)品，批號0405；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，批號1120708和0311；Trypsin（胰蛋白酶）由天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司提供，批號200503；DMSO（二甲基亞砜）由天津匯英化學(xué)試劑有限公司提供，批號20040526。
　　1.5 細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞用含10%滅活新生小牛血清的RPMI1640（NG108-15腫瘤細(xì)胞用DMEM）培養(yǎng)基在37℃，15%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　1. 6 儀器
　　Thermo Forma型CO2培養(yǎng)箱，美國產(chǎn)；Olympus型倒置顯微鏡，日本產(chǎn)；Biocell型酶標(biāo)儀，奧地利產(chǎn)；AG135型電子天平，瑞士產(chǎn)；培養(yǎng)瓶，美國產(chǎn)；3072型96孔板，丹麥產(chǎn)；3001型培養(yǎng)皿，美國產(chǎn)；DLF560型超凈工作臺，荷蘭產(chǎn)；HV-50自動高壓滅菌器，日本產(chǎn)。
　　2 方法
　　2.1 樣品的提取分離
　　將青天葵藥材陰干，去除雜質(zhì)，粉碎為粗粉，稱取9.0 kg藥材粗粉，用95%乙醇（食用）浸泡48 h后滲濾提取，用10倍量乙醇提取。合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，得粗提物，干燥后得921.3 g（得膏率10.2%）。將所得的粗提物用硅膠拌勻后，依次用石油醚（60～90℃）、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，回收溶劑，得石油醚部位180 g，醋酸乙酯部位87.5 g，正丁醇部位86 g，甲醇部位50 g。
　　2.2 MTT法
　　取對數(shù)生長期細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶和0.02鞹A消化后，用培養(yǎng)液稀釋。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μl（含有5 000個(gè)/ml腫瘤細(xì)胞）含10鸖的RPMI1640培養(yǎng)液，NG108-15細(xì)胞則用含10鸖的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞置37℃，10%CO2培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入最終濃度為15，30，60，120，240 μg/ml提取物的培養(yǎng)液，對照組則加入等體積溶劑的培養(yǎng)液，每組4孔，重復(fù)4次。置37℃，10%CO2培養(yǎng)5 d后，棄去上清液，加入200 μl/孔新鮮配置的含0.2 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入200 μl DMSO，振蕩混勻后，在酶標(biāo)儀上以波長為550 nm，參比波長為450 nm測定OD值。
　　2.3 藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率的計(jì)算方法［5］
　　腫瘤細(xì)胞生長抑制率（%）=［（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值）/對照組平均OD值］×100%
2.4 半數(shù)抑制濃度ⅠC50的計(jì)算
　　2.4.1 直線回歸法［6］
　　當(dāng)細(xì)胞生長抑制率與藥物濃度有對數(shù)關(guān)系時(shí)，以各個(gè)不同藥物的對數(shù)濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的細(xì)胞生長抑制率為縱坐標(biāo)，求出直線回歸方程，根據(jù)該方程計(jì)算出IC50。
　　2.4.2 改良寇氏法［7］
　　當(dāng)細(xì)胞生長抑制率與藥物濃度不存在對數(shù)關(guān)系時(shí)，采用寇氏法計(jì)算IC50。藥物IC50值的公式為：IC50=lg-1［Xm-i (∑p-0.5)］。式中Xm：設(shè)計(jì)的最大濃度的對數(shù)值；i：相鄰兩組濃度對數(shù)值之差；∑p：各組生長抑制率之和；0.5：經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。
　　3 結(jié)果
　　3.1 不同濃度提取物對白血病細(xì)胞株L1210的抑制結(jié)果見表1。石油醚部位和醋酸乙酯部位對白血病細(xì)胞株L1210都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。細(xì)胞生長抑制率與藥液濃度無對數(shù)關(guān)系，故采用寇氏法計(jì)算IC50，IC50分別為83.5 μg/ml和76.2 μg/ml。正丁醇部位和甲醇部位對白血病細(xì)胞株L1210基本無活性。表1 受試樣品對白血病細(xì)胞株L1210抑制的影響(略)
　　3.2 不同濃度提取物對白血病細(xì)胞株P(guān)388D1的抑制結(jié)果見表2。石油醚部位和

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