NK-104對人肝癌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的影響

【摘要】 研究日本新近研制的第三代3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）還原酶抑制劑匹伐他汀（pitavastatin， NK-104）對人肝癌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響。方法:采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以肝癌細(xì)胞系HepG 2為靶細(xì)胞，以不同濃度的藥物處理細(xì)胞48 h后，利用WST-8法測定NK-104對細(xì)胞增殖的影響;利用熒光染料Hoechst 33258染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核碎片;以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法檢測caspase-3活性。結(jié)果:NK-104（10 μmol/L）對HepG 2細(xì)胞有明顯抑制作用，可誘導(dǎo)HepG 2細(xì)胞凋亡，并能增強(qiáng)caspase-3基因的活性。結(jié)論:NK-104能夠誘導(dǎo)HepG 2細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與caspase-3依賴性凋亡調(diào)節(jié)信號通路有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 肝癌
　3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）還原酶抑制劑，統(tǒng)稱為抑制素，是重要的脂類合成抑制劑，主要在人體肝臟中代謝，臨床上廣泛應(yīng)用于治療高脂血癥［1］。 最近研究發(fā)現(xiàn)，HMG-CoA還原酶抑制劑具有生物學(xué)多效性，與降血脂無關(guān)。有報(bào)道其在體外具有抗癌作用［2］、體內(nèi)與5氟尿嘧啶（fluorouracil， 5-Fu）共同作用能夠延長晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他�。╬itavastatin， NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA還原酶抑制劑［4］。在血管內(nèi)皮細(xì)胞系NK-104通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B， PI3K-Akt）基因激活途徑對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用已有報(bào)道［5］，但其在肝癌細(xì)胞系的抗癌作用尚未見報(bào)道。本文在肝癌細(xì)胞系HepG 2通過2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑單鈉鹽 ｛［2-（2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium， monosodium salt］， WST-8｝、熒光染料Hoechst33258染色、流式細(xì)胞儀和半胱氨酸蛋白酶3比色法等檢測方法，研究NK-104對人肝癌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響，為NK-104在抗腫瘤中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1 材料和方法
　　1.1 主要材料與儀器 NK-104，日本興和有限公司（日本名古屋）和日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)公司（日本東京）產(chǎn)品;熒光染料Hoechst 33258、甲羥戊酸（ mevalonic acid， MEV）和碘化丙啶（propidium iodide， PI）染色液（PI 100 g/L， 1% Triton 100， 9 g/L NaCl），Sigma公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀，2000 FCA，美國BD公司產(chǎn)品。
　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法
　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG 2（美國ATCC公司產(chǎn)品）在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞種植于適當(dāng)培養(yǎng)皿中，90%的細(xì)胞融合時，用磷酸鹽緩沖液洗凈后，加入適量含有NK-104和MEV（ 1 mmol/L ）等藥物的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　1.2.2 WST-8方法 利用WST-8試劑盒對細(xì)胞增殖進(jìn)行測定。HepG 2細(xì)胞（1×104個細(xì)胞/孔）接種于含100 μl培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中，NK-104（ 0.1 ～100 μmol/L）治療48 h后，分別加入WST-8試劑10 μl（日本同仁化學(xué)研究所）培養(yǎng)2 h后，選擇450 nm波長，測定各孔的吸光度OD值。
　　1.2.3 Hoechst 33258染色 細(xì)胞經(jīng)藥物刺激 48 h 后，甲醇-冰乙酸（3∶1）細(xì)胞固定液4 ℃固定5 min，磷酸鹽緩沖液稍洗后，點(diǎn)加Hoechst 33258染色液， 10 min 。用濾紙沾去多余液體，封片劑封片后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核碎片。
　　1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測凋亡峰 在室溫下將刺激48 h后的細(xì)胞用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，并在適當(dāng)?shù)娜旧�緩沖液中吸取100 μl的細(xì)胞（1×105）至試 管中。加入200 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，再加800 μl PI染色液混勻，4 ℃避光30 min后，立即上機(jī)分析。
　　1.2.5 半胱氨酸蛋白酶3比色法 經(jīng)藥物治療 48 h 后收集細(xì)胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法試劑盒按照廠家說明進(jìn)行測定（Medical

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