銀染PCR

作者：閻麗，肖冰，宋衛(wèi)兵，耿炎，賴卓勝
【關(guān)鍵詞】 大腸癌;線粒體DNA;D
　　Mutation analysis of mitochondrial DNA in colorectal carcinoma tissues by silverstaining PCRSSCP
　　【Abstract】 AIM: To analyze the mutations of mitochondrial DNA in colorectal carcinoma tissues. METHODS: Sliverstaining Polymerase Chain ReactionSingle Strand Conformation Polymorphism (PCRSSCP) technique and sequence analysis were used to detect the point mutation changes on the Dloop region in mitochondrial DNA in 40 colorectal carcinomas together with the adjacent normal tissues. RESULTS: Among the 40 colorectal carcinomas, point mutations were found in 7 colorectal carcinoma tissues with the mutation rate of 18% （7/40）. Among the 9 point mutations, 3 point mutations were found in a colorectal carcinoma of Dukes stage D and the other 6 point mutations were found in 6 colorectal carcinomas of Dukes stage C. C to T mutation at np498 and at np16298 were found in 7 colorectal carcinomas with point mutations. CONCLUSION: A certain degree of point mutations is found in the Dloop region of mitochondrial DNA in colorectal carcinoma tissues, and the occurrence of mutations may be associated with colorectal carcinoma susceptibility and malignant grade, but whether the mutations have carcinogenicity needs further study.
　　【Keywords】 colorectal carcinoma; mitochondrial DNA; Dloop; mutation
　　【摘要】 目的： 研究大腸癌組織線粒體DNA的突變情況. 方法： 用銀染PCRSSCP技術(shù)結(jié)合測序的方法檢測40例大腸癌組織及其癌旁正常組織的線粒體DNA D環(huán)區(qū)的點(diǎn)突變情況. 結(jié)果: 40例大腸癌組織中檢測到7例點(diǎn)突變改變，突變率為18%（7/40），在檢測的9個(gè)突變位點(diǎn)，3個(gè)突變位點(diǎn)存在于Dukes D期的1例大腸癌中,其他6個(gè)突變位點(diǎn)分別存在于Dukes C期的6例大腸癌組織中,其中498位C→ T, 16298位C→T兩個(gè)突變位點(diǎn)在檢測到點(diǎn)突變的7例大腸癌組織中均檢測到. 結(jié)論：大腸癌組織線粒體DNA D環(huán)區(qū)存在一定程度的點(diǎn)突變，突變的發(fā)生可能與大腸癌的易感性和惡性程度有一定相關(guān)性, 但是否是大腸癌的發(fā)病機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究.
　　【關(guān)鍵詞】 大腸癌;線粒體DNA;D環(huán)區(qū);突變
　　0引言
　　目前認(rèn)為腫瘤的生物學(xué)特征不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，與核外線粒體DNA的改變也有非常重要的關(guān)系［1-2］，國內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA的D環(huán)區(qū)可能為線粒體DNA突變的熱點(diǎn)所在，但不同的腫瘤，有關(guān)該區(qū)突變的頻率報(bào)道存在明顯差異［3-4］. 為了進(jìn)一步研究大腸癌組織線粒體DNA的D環(huán)區(qū)是否存在共性的突變位點(diǎn)，并探討這些共性的突變位點(diǎn)是否與大腸癌的發(fā)生機(jī)制有一定相關(guān)性，我們用銀染PCRSSCP技術(shù)結(jié)合測序的方法對40例大腸癌組織及對應(yīng)的癌旁正常組織的線粒體DNA的D環(huán)區(qū)進(jìn)行研究.
　　1材料和方法
　　1.1材料200310/200405，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院手術(shù)切除證實(shí)為大腸癌患者的組織標(biāo)本40（男22, 女18）例, 年齡32~75(平均53.6)歲, Dukes分期：B期6例，C期28例，D期6例. 線粒體DNA提取試劑盒購自杭州Vgene公司; 2×Pfu PCR MasterMix一管便捷式PCR擴(kuò)增試劑盒購自清華大學(xué)天為時(shí)代公司；銀染PCRSSCP試劑購自廣州威佳生物試劑公司.
　　1.2方法按照線粒體DNA提取試劑盒上的步驟提取40例大腸癌及癌旁正常組織的線粒體DNA, 根據(jù)大腸癌線粒體DNA D環(huán)區(qū)的全長設(shè)計(jì)四對引物，分別為引物1: 5′GATCACAGGTCTATCACCCTATTAAC3′, 引物2: 5′GGTTTGGCAGAGATGTGTTTA3′擴(kuò)增355 bp的片段，引物3：5′GCTTCTGGCCACAGCACTTA3′，引物4: 5′GCCCGTCTAAACATTTTCAG3′，擴(kuò)增313 bp的片段，引物5: 5′CTTTCATGGGGAAGCAGATT3′，引物6: 5′TGTTGGT

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