PTTG、VEGFC 的表達及微淋巴管密度與非小細胞肺癌臨床病理特征的

作者：尹秋偉 郭旭峰 胡國強 趙健 李希波

【摘要】 目的 檢測非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）、癌旁組織及肺良性病變組織中垂體瘤轉化基因（pituitary tumor transforming gene,PTTG）及血管內皮生長因子?C(vascular endothelial growth factor，VEGF?C)的表達和微淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LMVD)值，并探討三者間的相互關系。方法 應用實時熒光定量 PCR 和免疫組織化學方法檢測非小細胞肺癌組織中 PTTG、VEGF?C mRNA 和蛋白及 LMVD 的表達，分析 PTTG、VEGFC 及 LMVD 與 NSCLC 臨床病理特征的關系，以及 PTTG、VEGFC 和 LMVD 三者之間的相互關系。同時，對隨訪資料進行生存分析，繪制生存率曲線，探討 PTTG、VEGF?C 對肺癌患者預后的影響。結果 PTTG、VEGF?C mRNA 和 LMVD 值在不同性質的肺病變組織中的表達均有顯著性差異(P均＜0?05)，在不同年齡、性別、是否吸煙、腫瘤大小、組織學類型及分化程度間無顯著性差異(P均＞005)，在TNM分期、淋巴結轉移與否及預后組間有顯著性差異(P均＜005)。PTTG、VEGF?C 蛋白表達在淋巴結轉移與否及預后組間有顯著性差異(P均＜005)。生存率曲線顯示 PTTG、VEGF?C 高表達者生存時間均短于低/無表達者(P=0030，0027，n=65)。PTTG 在肺癌組織中的表達與 VEGF?C、LMVD 密切相關，隨著 PTTG 強度增加，VEGFC 分級及 LMVD 值亦增加。結論 PTTG、VEGF?C 的過度表達促使腫瘤微淋巴管的生成，進而促進了腫瘤細胞淋巴結轉移。PTTG 和 VEGF?C 表達可作為判斷 NSCLC 生物學行為及肺癌患者預后的良好指標，VEGF?C 有望成為肺癌抗淋巴管治療的新靶點。
【關鍵詞】 垂體瘤轉化基因；血管內皮生長因子C；微淋巴管密度；實時熒光定量PCR
　　垂體瘤轉化基因(PTTG)是1997年〔1〕 被發(fā)現并證實與細胞增殖、分化和凋亡有關的癌基因。血管內皮生長因子(VEGF)C 被認為是迄今發(fā)現的唯一特異性新生淋巴管刺激因子,可促進腫瘤微淋巴管生成及腫瘤細胞向區(qū)域淋巴結轉移。有研究〔2〕 顯示 PTTG 可通過促進 VEGFC 的過度表達，促使腫瘤細胞發(fā)生淋巴結轉移。國內外已報道 PTTG 在食管癌、胃癌和卵巢癌等多種腫瘤中高表達，但目前尚未見對 PTTG 在肺癌中表達研究的報道。以往關于 VEGFC 的研究多為蛋白半定量分析，本實驗結合免疫組化應用實時熒光定量 PCR 對非小細胞肺癌(NSCLC)組織中 PTTG、VEGF?C 的表達進行精確定量分析，并檢測微淋巴管密度(LMVD)的表達情況,旨在探討它們與 NSCLC 臨床病理特征及預后的關系。
　　1 材料與方法
　　1?1 研究對象
　　收集65例 NSCLC 組織，均來自手術切除且經病理科常規(guī)病理學檢查證實。男∶女為40∶25，年齡43～78（中位數58?8）歲。依據1997年新的修訂標準進行TNM分期，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期28例，Ⅲ期26例，Ⅳ期4例；按病理形態(tài)學分為鱗狀細胞癌36例，腺癌26例，大細胞癌3例；按分化程度分為高分化5例，中分化18例，低分化42例；按有無淋巴結轉移分為有淋巴結轉移37例，無淋巴結轉移28例。所有患者均為原發(fā)性 NSCLC，術前均未接受過化療或放療等任何治療。同時取65例配對的癌旁組織和20例肺良性瘤樣病變組織(包括結核球10例，錯構瘤4例，炎性假瘤4例，肺纖維組織細胞瘤1例，肺隱球菌感染1例)。癌旁組織為距腫塊邊緣5 cm以上的正常組織。肺癌組織和肺良性病變組織均取自腫塊中央非壞死部分。標本經10％甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。65例患者無住院期間死亡，隨訪日期以患者手術日期起計算，術后隨訪至2006年5月。
　　1?2 實驗用品
　　RNAiso Reagent、SYBR ExScriptTM RT?PCR Kit(DRR053S) 均購自TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，其他各種化學試劑均為進口或國產分析純。采用ABI PRISM 7000 實時 PCR擴增儀。兔抗人多克隆抗體 PTTG、VEGFC、VEGFR?3及免疫組織化學試劑盒PV9000均購自北京中山生物技術公司。
　　1?3 實驗方法
　　1?3?1 實時熒光定量
　　1?3?1?1 總RNA的提取
　　每100 mg組織勻漿后，加入TRIzol Reagent 1 ml，然后加入0?2 ml氯仿，離心后吸取上清，加入05 ml異丙醇，離心沉淀后棄上清，75% 乙醇洗沉淀，DNase Ⅰ酶解可能殘余的基因組DNA。RNA 溶于DEPC 水，甲醛變性凝膠電泳，分光光度計檢測濃度和純度。
　　1?3?1?2 cDNA的合成
　　反轉錄儀為 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司)。采用10 μl反轉錄反應體系，4μl 溶解于去RNA酶的雙蒸水，05μl 隨機引物（100 μmol），2 μl 5×ExSciptTM Buffer，025μl ExSciptTMRTase（200 U/μl），025 μl RNA酶抑制劑（40 U/μl），05μl dNTP 混合物(各10 mmol)，加去RNA酶的蒸餾水至10μl。反應條件：42 ℃15 min（反轉錄反應）；95℃2 min（反轉錄酶的失活反應）。
　　1?3?1?3 熒光定量PCR擴增
　　引物：由TaKaRa公司提供的高特異性引物, PPTG 上游引物序列5′?CCTCAGATGAATGCGGCTGTTA?3′，下游引物序列5′?AGCTTCAGCCCATCCTTAGCAA?3′，擴增片段為118 bp。VEGF?C 上游引物序列5′CAGCACGAGCTACCTCAGCAAG?3′，下游引物序列5′?TTTAGACATGCATCGGCAGGAA3′，擴增片段為115 bp。熒光定量 PCR 儀為ABI PRIS

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