紫杉醇和吉西他濱對(duì)鼻咽癌HNE2細(xì)胞系 協(xié)同放射增敏的作用

【摘要】目的觀(guān)察紫杉醇、吉西他濱兩藥聯(lián)合對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系HNE2的放射增敏作用，并探討其可能機(jī)制。方法將HNE2細(xì)胞分為單純照射組、吉西他濱（GE）＋照射組、紫杉醇（PA）＋照射組及GE PA 照射組，用克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)算兩藥物單用及合用的放射增敏比，流式細(xì)胞儀法分別檢測(cè)、比較各組的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期變化。Westernblot法測(cè)定各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl?2、bax的表達(dá)水平。結(jié)果吉西他濱、紫杉醇及兩藥聯(lián)合使用的放射增敏比分別為1.06、1.13和1.34。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示吉西他濱聯(lián)合射線(xiàn)主要誘導(dǎo)S期阻滯（96.03％），誘導(dǎo)凋亡率為31.62％；紫杉醇聯(lián)合射線(xiàn)引起的阻滯以G2＋M期為主（75.71%），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率為44.56%；兩藥合用并聯(lián)合照射后G2＋M期比例（65.98%）有所下降，同時(shí)S期比例（33.33%）有所上升（與PA 放射組比較），細(xì)胞凋亡率達(dá)到73.28%。在四組中bcl?2的表達(dá)呈逐步下降趨勢(shì)，而bax的表達(dá)則呈逐步上升趨勢(shì)。結(jié)論吉西他濱、紫杉醇單用及兩藥聯(lián)合對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系HNE2均有放射增敏作用，且兩者協(xié)同增敏作用顯著高于單獨(dú)增敏作用，顯示了兩藥聯(lián)合應(yīng)用有助于提高鼻咽癌的放射敏感性。兩者協(xié)同放射增敏作用的機(jī)制可能與凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】紫杉醇吉西他濱鼻咽癌放射增敏

0引言

放射治療一直是治療鼻咽癌的首選方法。近年來(lái)已有作者報(bào)道分別將紫杉醇[1]（Paclitaxel，PA）和吉西他濱[2]（Gemcitabine，GE）聯(lián)合放射治療鼻咽癌，以增加其放射敏感性，但兩藥聯(lián)合使用增加放射敏感性的報(bào)道尚屬少見(jiàn)。本試驗(yàn)選用鼻咽癌細(xì)胞株HNE2作為研究對(duì)象，研究了紫杉醇和(或)吉西他濱聯(lián)合放射對(duì)HNE2細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以探討PA和GE協(xié)同作用對(duì)HNE2細(xì)胞的放射敏感性的影響及其可能機(jī)制。

1材料和方法

1.1細(xì)胞株、藥物和試劑人鼻咽癌HNE2細(xì)胞株購(gòu)自湖南湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所。紫杉醇和吉西他濱分別為美國(guó)百時(shí)美施貴寶公司及禮來(lái)公司產(chǎn)品。兔抗人多克隆第一抗體及生物素標(biāo)記的第二抗體由北京中山生物技術(shù)有限公司提供，系美國(guó)SantaCruz產(chǎn)品。噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司，RPMI－1640、胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。

1.2細(xì)胞及培養(yǎng)條件人鼻咽癌HNE2細(xì)胞株培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中，添加100IU/ml青霉素及鏈霉素，37℃、100%濕度、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3MTT法測(cè)定藥物IC50及IC10值HNE2細(xì)胞按103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，待16～18h后貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將PA用培養(yǎng)基依次稀釋為500μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml、0.005μg/ml，分別按100μl/孔加入96孔板，每一濃度設(shè)3復(fù)孔，并設(shè)正常對(duì)照孔及空白調(diào)零孔。同法將HNE2細(xì)胞按5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，GE依次稀釋為2000μg/ml、200μg/ml、20μg/ml、2μg/ml、0.2μg/ml、0.02μg/ml加入96孔板。置37℃培養(yǎng)箱孵育24h后，棄去藥物及陳舊培養(yǎng)基，每孔加新鮮配制的MTT（5mg/ml）20μl再次孵育4h，棄去MTT液，每孔加DMSO150μl，振蕩15min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度D。重復(fù)3遍。腫瘤細(xì)胞抑制率＝（1?實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度）×100%

1.4克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定藥物放射增敏性將正常細(xì)胞、GE作用24h后細(xì)胞、PA作用24h后細(xì)胞及兩藥聯(lián)合作用（濃度同上）24h后細(xì)胞組常規(guī)消化后分別按不同照射劑量以不同密度接種于60mm培養(yǎng)皿，每組細(xì)胞給予6MVX射線(xiàn)單次照射0、2、4、6、8Gy，恒溫箱中培養(yǎng)12d。12d后取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，甲醇固定15min，去除固定液，姬姆薩染色30min，對(duì)含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。多靶單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線(xiàn)并計(jì)算增敏比。 論文網(wǎng)在線(xiàn)

1.5流式細(xì)胞分析將培養(yǎng)于50ml培養(yǎng)瓶中呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HNE2細(xì)胞隨機(jī)分為：（1）單純照射組、（2）GE＋放射組、（3）PA＋放射組、（4）兩藥聯(lián)合＋放射組。單純照射組僅給予6Gy照射，其余三組分別給予GE（0.2μg/ml）、PA（0.1μg/ml）及GE和PA的混合液作用24h后棄藥并照射6Gy。以上四組共同孵育24h，常規(guī)消化后800r/mim離心5min，棄上清，PBS清洗2遍，80%乙醇4℃固定過(guò)夜，離心去乙醇，PBS清洗2遍，用RNase（終濃度0.02mg/ml）、PI（終濃度0.1mg/ml）及0.3%的Triton?X100混合配制成的PI染液避光染色30min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡情況。

1.6WesternBlot法測(cè)定bcl?2、bax的表達(dá)分組及每組處理方法同1.5，將四組細(xì)胞常規(guī)消化后置EP管800r/min離心5min，棄上清，PBS清洗2遍，每管加新鮮配制的裂解液100μl，4℃裂解30min，隨后4℃12000r/min離心15min，吸上清，每個(gè)樣本均分裝成5μl及60μl兩管，－20℃保存。將5μl/管蛋白加上樣buffer沸水煮5min，BCA法測(cè)樣本蛋白濃度。用15%的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣本蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，與兔抗人bcl－2及bax多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜。次日加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，ECL顯色，X射線(xiàn)片顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所用數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1GE及PA的IC50和IC10值MTT實(shí)驗(yàn)表明不同濃度梯度的PA及GE作用細(xì)胞24h后，細(xì)胞抑制率隨藥物濃度的增加而增加，結(jié)果見(jiàn)表1。應(yīng)用IC50計(jì)算軟件求出GE的IC50及IC10分別為173.2μg/ml和0.210μg/ml。PA的IC50及IC10分別為2.73μg/ml和0.13μg/ml。以下的實(shí)驗(yàn)均選用兩種藥物的大致IC10濃度0.2μg/ml（GE）和0.1μg/ml（PA）。表1GE及PA對(duì)HNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

2.2GE、PA及GE PA對(duì)細(xì)胞放射敏感性的影響將正常細(xì)胞、GE、PA作用后細(xì)胞及兩者聯(lián)合作用后細(xì)胞分別給予0、2、4、6、8Gy射線(xiàn)照射后多靶單擊模型擬所得結(jié)果如圖1。單純對(duì)照組細(xì)胞存活曲線(xiàn)的D0=3.17，Dq＝1.73；GE組的D0=2.99，Dq＝1.52；PA組的D0=2.8，Dq＝1.44；聯(lián)合用藥組的存活曲線(xiàn)與前三組相比明顯下移，肩峰變窄，D0=2.37，Dq＝1.07。吉西他濱的增敏比（單純照射組D0與吉西他濱組D0之比值，以下類(lèi)推）為1.06，紫杉醇的增敏比為1.13，而兩藥聯(lián)合后的增敏比為1.34，明顯高于兩藥分別使用時(shí)的增敏比(P

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