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有關(guān)藥用植物代謝組學(xué)的研究進(jìn)展
摘要：從技術(shù)步驟、分析方法以及實(shí)際應(yīng)用三個(gè)方面對(duì)當(dāng)前藥用植物代謝組學(xué)研究領(lǐng)域的一些理論問(wèn)題和實(shí)踐中面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述。關(guān)鍵詞： 藥用植物；代謝組學(xué)；功能基因組學(xué)
代謝組學(xué)是對(duì)生物體內(nèi)代謝物進(jìn)行大規(guī)模分析的一項(xiàng)技術(shù)［1］，它是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分（如圖1所示），藥用植物代謝組學(xué)主要研究外界因素變化對(duì)植物所造成的影響，如氣候變化、營(yíng)養(yǎng)脅迫、生物脅迫，以及基因的突變和重組等引起的微小變化，是物種表型分析最強(qiáng)有力的工具之一。在現(xiàn)代中藥研究中，代謝組學(xué)在藥物有效性和安全性、中藥資源和質(zhì)量控制研究等方面具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。另外，在對(duì)模式植物突變體文庫(kù)或轉(zhuǎn)基因文庫(kù)進(jìn)行分析之前，代謝組學(xué)往往是首先考慮采用的研究方法之一。目前，國(guó)外已有成功利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)擬南芥突變株進(jìn)行大規(guī)模基因篩選的例子，這為與重要性狀相關(guān)基因功能的闡明和選育可供商業(yè)化利用的轉(zhuǎn)基因作物奠定了基礎(chǔ)。
圖1系統(tǒng)生物學(xué)研究的四個(gè)層次 略
目前，還有許多經(jīng)濟(jì)作物的全基因組測(cè)序計(jì)劃尚未完成，由于代謝組學(xué)研究并不要求對(duì)基因組信息的了解，所以在與這些作物有關(guān)的研究領(lǐng)域具有更大的利用價(jià)值，這也是其與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究相比的優(yōu)勢(shì)之一。代謝組學(xué)研究涉及與生物技術(shù)、分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和信息學(xué)相關(guān)的大量知識(shí)，F(xiàn)iehn［2］對(duì)代謝組學(xué)有關(guān)的研究方向進(jìn)行了分類（見(jiàn)表1）。
1代謝組學(xué)研究的技術(shù)步驟
代謝組學(xué)研究涉及的技術(shù)步驟主要包括植物栽培、樣本制備、衍生化、分離純化和數(shù)據(jù)分析5個(gè)方面（見(jiàn)圖2）。
1.1植物栽培
對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行培育的目的是為了對(duì)樣本的穩(wěn)定性進(jìn)行控制，相對(duì)于微生物和動(dòng)物而言，植物的人工栽培需要考
表1代謝組學(xué)的分類及定義 略
慮更多的問(wèn)題，如中藥材在不同年齡、不同發(fā)育階段、不同部位以及光照、水肥、耕作等環(huán)境因素的微小差異都可引起生理狀態(tài)的變化，而這些非可控及可控雙重因素的影響很難進(jìn)行精確的控制，從而影響藥用植物代謝組研究的重復(fù)性。為了解決以上問(wèn)題，推薦使用大容量的培養(yǎng)箱［3］，定時(shí)更換培養(yǎng)箱中栽培對(duì)象的位置，以及使用無(wú)土栽培技術(shù)等，F(xiàn)ukusaki E［4］利用無(wú)土栽培系統(tǒng)將水和養(yǎng)分直接引入植物根部，并且對(duì)供給量進(jìn)行精確地控制，大大提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。
1.2樣本制備
為了獲得穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，樣本制備需要考慮樣本的生長(zhǎng)、取樣的時(shí)間和地點(diǎn)、取樣量以及樣本的處理方法等問(wèn)題，并根據(jù)分析對(duì)象的分子結(jié)構(gòu)、溶解性、極性等理化性質(zhì)及其相對(duì)含量大小對(duì)提取和分離的方法進(jìn)行選擇，逐一優(yōu)化試驗(yàn)方案。Maharjan RP等［5］用6種方法分別對(duì)大腸桿菌中代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)用－40℃甲醇進(jìn)行提取的效果最好�，F(xiàn)階段代謝組學(xué)的分析對(duì)象主要集中在親水性小分子，尤其是初級(jí)代謝產(chǎn)物，氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用(GC?MS)和毛細(xì)管電泳?質(zhì)譜（CE?MS）聯(lián)用都是分析親水小分子的重要技術(shù)。Fiehn O等［6］使用GC?MS對(duì)擬南芥葉片中的親水小分子進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)酒石酸半縮醛、檸蘋酸、別蘇氨酸、羥基乙酸等15種植物代謝物。
1.3衍生化處理
對(duì)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的衍生化處理取決于所使用的分析設(shè)備，GC?MS系統(tǒng)只適合對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，高效液相色譜法（HPLC）一般則使用紫外或熒光標(biāo)記的方法對(duì)樣本進(jìn)行衍生處理，Blau K［7］對(duì)酯化、�；�、烷基化、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等衍生方法進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明。然而離子化抑制常使得質(zhì)譜分析過(guò)程中目標(biāo)代謝產(chǎn)物的離子化效率降低，這主要是由于分離過(guò)程中污染物與目標(biāo)代謝物難以完全分離開(kāi)所引起的，優(yōu)化色譜分離時(shí)間可有效緩解離子化抑制，然而在實(shí)際操作中不可能對(duì)上百種代謝產(chǎn)物的分離時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，利用非放射性同位素稀釋法進(jìn)行相對(duì)定量可以很好的解決該問(wèn)題。Han DK等［8］應(yīng)用同位素編碼的親和標(biāo)記（ICAT），根據(jù)經(jīng)誘導(dǎo)分化的微粒蛋白及其同位素標(biāo)記物的峰面積比，對(duì)該蛋白的相對(duì)含量進(jìn)行分析。Zhang R等［9］發(fā)現(xiàn)同位素標(biāo)記技術(shù)也可用于代謝組學(xué)的研究，但是卻存在許多困難�；铙w的同位素標(biāo)記方法對(duì)于同位素的洗脫是一種非常有潛力的技術(shù)，目前關(guān)于使用34 s的研究已有報(bào)道［10］。
圖2代謝組學(xué)研究技術(shù)步驟 略
1.4分離和定量
分離是代謝組學(xué)研究中的重要步驟，與質(zhì)譜聯(lián)用的色譜和電泳分析技術(shù)都是使用紫外或電化學(xué)檢測(cè)的方法進(jìn)行定量，其對(duì)代謝組數(shù)據(jù)的分辨率與定量能力都有一定的影響。Tomita M等［11］總結(jié)了各種色譜分離法中經(jīng)常遇到的技術(shù)問(wèn)題，認(rèn)為毛細(xì)管電泳和氣相色譜法由于具有較高的分辨率，已成為代謝組學(xué)研究的常規(guī)技術(shù)手段之一，液相色譜因其適用范圍廣，應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。
Tanaka N等［12］用高效液相色譜對(duì)樣品進(jìn)行分離，認(rèn)為使用硅膠基質(zhì)填充毛細(xì)管整體柱的高效液相色譜系統(tǒng)具有用量少、靈敏性高、低壓降高速分離等優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，Tolstikov V等［13］也使用硅膠填充的毛細(xì)管液相色譜方法對(duì)聚戊烯醇類異構(gòu)體進(jìn)行了有效分離，獲得了很好的分辨率。Tanaka N等［14］發(fā)現(xiàn)二維毛細(xì)管液相色譜法的分辨率比傳統(tǒng)的高效液相法高10倍。相對(duì)于其他色譜方法而言，超臨界流體色譜（SFC）是分離疏水代謝物最具潛力的技術(shù)之一，特別適用于分離那些傳統(tǒng)HPLC難以分析的疏水聚合物，Bamba T等［15］通過(guò)SFC對(duì)聚戊烯醇進(jìn)行分析，證明其具有較好的分離能力。針對(duì)質(zhì)譜中存在的共洗脫現(xiàn)象，Halket JM等［16］發(fā)明了一種適用于GC?MS的反褶積系統(tǒng)，對(duì)共洗脫的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離與識(shí)別。Aharoni A等［17］使用傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT?ICR?MS）對(duì)非目標(biāo)代謝物進(jìn)行分析，快速掃描植物突變樣品，獲得了一定量的代謝成分。
與分離一樣，定量能力也是代謝組學(xué)研究中的重要因素，其取決于各分析系統(tǒng)的線性范圍。傅立葉轉(zhuǎn)換核磁共振（FT?NMR)、傅立葉紅外光譜（FT?IR）以及近場(chǎng)紅外光譜法（NIR）等技術(shù)由于敏感性低，重復(fù)性受共洗脫現(xiàn)象影響較小也被用于檢測(cè)中。近年來(lái)，F(xiàn)T?NMR技術(shù)常被用于植物代謝組的指紋圖譜研究 ［18］，但由于NMR分析需要樣品量較大，分析結(jié)果易受污染，Griffin J L ［19］發(fā)現(xiàn)將統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別與FT?NMR相結(jié)合可以對(duì)代謝物進(jìn)行全面分析。除FT?NMR之外，F(xiàn)T?IR通過(guò)對(duì)有機(jī)成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行常規(guī)光譜測(cè)定，也可適用于代謝組學(xué)的研究，特別是應(yīng)用于構(gòu)建代謝組學(xué)的指紋
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