談北豆根提取物中有效成分分析方法的建立

摘要：　目的采用酸性染料比色法測定北豆根提取物中北豆根總堿（ＴＡＭＤ）的含量，采用高效液相色譜（ＨＰＬＣ）法測定蝙蝠葛堿（Ｄａｕｒｉｃｉｎｅ）的含量。方法溴甲酚綠在無水甲醇（ｐＨ ＝６）中，可與ＴＡＭＤ 直接絡合生成綠色化合物，用于比色測定，最大吸收波長為６２０ ｎｍ。ＨＰＬＣ 法，色譜柱：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８ 柱；流動相：乙腈∶水∶磷酸＝１６∶８４∶０．１５；流速：０．５ ｍｌ·ｍｉｎ－１ ；檢測波長：２０８ ｎｍ。結果酸性染料比色法：線性范圍為６ ～４０ μｇ· ｍｌ－１ ，r ＝０．９９９ ８ （n ＝７），平均加樣回收率為９９．１８％，RSD ＝０．７４％；ＨＰＬＣ 法：線性范圍為０．０１ ～０．１ ｍｇ· ｍｌ－１ ，r ＝０．９９９ ８（n ＝７） ，平均加樣回收率為９８．３２％， RSD＝０．９４％。結論建立的方法靈敏、準確、重現(xiàn)性好，可作為北豆根提取物中ＴＡＭＤ 和蝙蝠葛堿的含量分析方法。

關鍵詞： 北豆根總堿 蝙蝠葛根 酸性染料比色法 高效液相色譜法
　
　　北豆根為防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum ＤＣ．的干燥根莖，其有效部位是生物堿�，F(xiàn)已知北豆根中含有近２０ 種生物堿，總堿含量可達１％以上，其中含量最高的生物堿為蝙蝠葛堿，其含量約占總生物堿的５０％左右［１］ 。北豆根總堿（ＴＡＭＤ）對呼吸道致病菌有抑菌作用，尤其對肺炎球菌效果更為顯著。其制劑北豆根片可治療急性咽炎、扁桃體炎，經過多年的臨床應用已收入２００５ 版《中國藥典》。２００５ 版《中國藥典》用酸堿滴定法控制含量，終點不易判斷，誤差大。本實驗采用酸性染料比色法測定提取物中ＴＡＭＤ 的含量，采用高效液相色譜法測定提取物中蝙蝠葛堿的含量，從而用這兩個指標控制提取物的質量。
　�。� 　器材

　　ＨＰ －８４５３ 紫外－可見分光光度計；ＡＧ －２５４ 型電子分析天平（瑞士梅特勒）；ＷＴ －０２ 型電熱恒溫干燥箱（北京恒星醫(yī)療器械廠）；ＺＦＱ －８５Ａ 型旋轉蒸發(fā)儀（上海醫(yī)械專機廠）；Ｒ２００２ 型旋轉蒸發(fā)儀（上海申順科技公司）；ＪＡＳＣＯ 高效液相色譜儀（ＵＶ －１５ 紫外－可見檢測器，ＲＵ －１５８０ 泵，ＣＫＣｈｏｍ 色譜工作站，日本）；北豆根飲片（市售，承德產，經鑒定為蝙蝠葛）；北豆根堿（對照品，自制，含量９９．０％）；９５％乙醇、氨水、硫酸、三氯甲烷、無水甲醇、磷酸、酚酞為分析純； 甲醇、乙腈為色譜純。
　�。� 方法與結果
　　２．１ 酸性染料比色法測定提取物中ＴＡＭＤ 的含量［２］
　�。玻�１．１ 比色原理不吸收可見光的無色物質通過絡合、氧化還原等反應生成有色物質，可用于比色測定。實驗證明，溴甲酚綠在無水甲醇（ｐＨ ＝６）中，可與ＴＡＭＤ 直接絡合生成綠色化合物，用于比色測定。
　�。玻�１．２ 最大吸收波長的選擇精密稱取蝙蝠葛堿對照品（６０℃干燥至恒重）１０．０ ｍｇ 置５０ ｍｌ 容量瓶中，加無水甲醇溶解，最后用無水甲醇定容至５０ ｍｌ，作為對照品溶液。

　　精密吸取對照品溶液１．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，加入０．１％溴甲酚綠溶液０．２ ｍｌ，用無水甲醇定容，在２００ ～７００ ｎｍ 進行掃描，選擇最大吸收波長，確定最大吸收波長為６２０ ｎｍ。
　　２．１．３ 顯色劑用量的考察分別精密吸�。埃�１％溴甲酚綠溶液０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８，０．９ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，再分別加入對照品溶液１．０ ｍｌ，用無水甲醇定容，在６２０ ｎｍ 處測定吸收度。結果見表１。
　　表1 蝙蝠葛堿與溴酚綠絡合后的吸收度（略）
　　結果表明，顯色劑用量為０．２ ｍｌ 時吸收度最大，故選用顯色劑用量為０．２ ｍｌ。
　�。玻�１．４ 顯色穩(wěn)定性的考察以加入０．１％溴甲酚綠溶液０．２ ｍｌ的樣品為考察對象，在１２０ ｍｉｎ 內于６２０ ｎｍ 處測定吸收度，隨行試劑空白。結果見表２。
　　表2 蝙蝠葛堿的顯色穩(wěn)定性考察（略）
　　平均吸收度為０．４２３，RSD為０．０３％，表明吸收度在１２０ ｍｉｎ內沒有明顯變化。
　�。玻�１．５ 標準曲線的制備分別精密吸取對照品溶液０．３，０．５，０．８，１．０，１．２，１．５，２．０ ｍｌ，置１０ ｍｌ 容量瓶中，加入０．１％溴甲酚綠溶液０．２ ｍｌ，于６２０ ｎｍ 測定吸收度，隨行試劑空白。以蝙蝠葛堿濃度C 對吸收度A 進行線性回歸，得標準曲線方程：C ＝４９．９１A －０．８８，r ＝０．９９９ ８ （n ＝７），線性范圍為６ ～４０ μｇ· ｍｌ－１ 。
　　２．１．６ 精密度實驗�。玻�１．５ 中的樣品（２０ μｇ· ｍｌ－１ ）測定吸收度，重復測定５ 次，平均吸收度為０．４２３，RSD 為０．１１％。
　　２．１．７ 加樣回收率實驗精密稱取北豆根提取物２．０ ｍｇ（總堿含量以北豆根堿計為９２．７％），置１０ ｍｌ 容量瓶中，加無水甲醇使溶解，超聲提�。保� ｍｉｎ，用無水甲醇定容至１０ ｍｌ，總堿濃度以蝙蝠葛堿計０．１８５ ｍｇ· ｍｌ－１ 。蝙蝠葛堿對照品溶液濃度為０．２ ｍｇ· ｍｌ－１ 。分別精密吸取兩種溶液各０．４，０．５，０．６，０．８，１．０ ｍｌ，一一對應混合于１０ ｍｌ 容量瓶中，無水甲醇定容。測定結果見表３。
　　表3 TAMD的回收率（略）
　　２．２ 高效液相色譜法測定提取物中蝙蝠葛堿含量［３］
　�。玻�２．１ 色譜條件色譜柱：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ －Ｃ１８ （５ μｍ，４．６ ｍｍ ×２５０ ｍｍ）；流動相：乙腈∶水∶磷酸＝１６∶８４∶０．１５（V∶V∶V）；流速：０．５ ｍｌ· ｍｉｎ－１；波長２０８ ｎｍ；柱溫：室溫；進樣量２０ μｌ；理論塔板數(shù)２ ３００。
　２．２．２ 北豆根對照品、提取物和藥材的ＨＰＬＣ 的圖譜見圖１。
　　圖1 北豆根對照品提取物和藥材的HPLC圖譜（略）
　�。玻�２．３ 標準曲線的繪制精密稱取蝙蝠葛堿對照品（６０℃干燥至恒重）５．０ ｍｇ 置２５ ｍｌ 容量瓶中，用流動相溶解并定容，作為對照品溶液。分別精密吸取對照溶液０．５，１．０，１．５，２．０，３．０，４．０，５．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，按上述條件進行檢測，以峰面積（Y）對濃度（X）進行直線回歸，得回歸方程為：Y ＝１．５３ ×１０８ X ＋１．１８ ×１０４ ；r ＝０．９９９ ８ （n ＝７） ， 線性范圍為０．０１ ～０．１ ｍｇ· ｍｌ－１ 。
　　２．２．４ 精密度實驗選用“

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