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hTERT基因啟動(dòng)子調(diào)控HSV
作者：卞卡，張惠中，任繼鴻，趙輝，成詩(shī)銀【關(guān)鍵詞】 端粒,末端轉(zhuǎn)移酶；啟動(dòng)區(qū)（遺傳學(xué)）；宮頸腫瘤；tk基因
【Abstract】 AIM: To observe the killing effect of HSVtk/GCV system on cervical carcinoma cells under the control of hTERT(human telomerase reverse transcriptase) core promoter. METHODS: An eukaryotic expression vector containing HSVtk gene under the control of hTERT core promoter was constructed and was transfected into cervical carcinoma cells(HeLa) and vessel endothelial cells(ECV304) by liposome method. Transfected cells were then selected with G418 and RTPCR was used to detect the tk gene expression in HeLa cells and ECV304 cells. After GCV was added, flow cytometry method were applied to investigate its cell killing effect. RESULTS: pCIneo/hTERTtk/GCV system under the control of hTERT induced the apoptosis in more than 36.7% of cervical carcinoma cells, but not in normal vessel endothelial cells. CONCLUSION: hTERT gene core promoter is tumorspecific and may be useful in tk gene therapy of cervical carcinoma and in reducing the side effects of the therapy.
【Keywords】 telomerase; promoter regions (genetics); cervix neoplasms; tk gene
【摘要】目的： 研究人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因核心啟動(dòng)子調(diào)控的人單純皰疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韋（HSVtk/GCV）系統(tǒng)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的體外殺傷作用.方法： 構(gòu)建hTERT基因啟動(dòng)子調(diào)控的tk基因真核表達(dá)載體pCIneo/hTERTtk，分別用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304），新霉素（G418）篩選陽(yáng)性克隆擴(kuò)增. 用RTPCR法比較兩種細(xì)胞tk基因的表達(dá)情況；給予前藥更昔洛韋（GCV），用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hTERT調(diào)控的HSVtk/GCV系統(tǒng)對(duì)兩種細(xì)胞的殺傷作用. 結(jié)果： hTERT啟動(dòng)子調(diào)控下的HSVtk/GCV系統(tǒng)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞有明顯的殺傷作用，使36.7%的細(xì)胞凋亡；而對(duì)正常細(xì)胞ECV304作用則不明顯. 結(jié)論： hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的tk基因治療是一種具有腫瘤特異性的治療方法，有望解決腫瘤基因治療中的特異性殺傷及降低毒副作用等問(wèn)題.
【關(guān)鍵詞】 端粒，末端轉(zhuǎn)移酶；啟動(dòng)區(qū)（遺傳學(xué)）；宮頸腫瘤；tk基因
0引言
宮頸癌是死亡率較高的惡性腫瘤,傳統(tǒng)治療方法以手術(shù)、化療、放療為主,但晚期不宜手術(shù)者及對(duì)放化療不敏感者5 a生存率仍不理想. 隨著分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展,自殺基因療法在腫瘤治療中取得了一定療效，其利用人單純皰疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韋（human simplex virusthymidine kinase/ganciclovir, HSVtk/GCV）將更昔洛韋（ganciclovir, GCV）等前藥磷酸化為細(xì)胞毒產(chǎn)物,從而阻止細(xì)胞DNA合成, 殺傷腫瘤細(xì)胞［1-2］. 有研究發(fā)現(xiàn)，由于缺乏特異性，tk基因修飾的正常組織細(xì)胞經(jīng)前藥治療后會(huì)與腫瘤細(xì)胞一起被殺死，造成對(duì)正常組織的殺傷. hTERT基因在90%的人類腫瘤組織中呈過(guò)表達(dá)［3］，具有明顯的腫瘤特異性.我們采用克隆hTERT基因啟動(dòng)子，利用其在腫瘤細(xì)胞中特有的啟動(dòng)活性來(lái)控制HSVtk的腫瘤特異性表達(dá)的方法，旨在實(shí)現(xiàn)其在腫瘤細(xì)胞中的特異性殺傷作用.
1材料和方法
1.1材料Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶以及電泳中所用marker DL2000和DGL2000均購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自日本Promega公司；質(zhì)粒提取、純化試劑盒購(gòu)自北京天為時(shí)代公司；轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Introvigen公司；含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因與tk基因的pGL3 Basic質(zhì)粒由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院耳鼻喉科韓明鯤饋贈(zèng)；pCIneo質(zhì)粒由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腎內(nèi)科楊潔饋贈(zèng)；GCV購(gòu)自廣東麗珠集團(tuán)；大腸桿菌菌株JM109，宮頸癌細(xì)胞HeLa和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304均由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)科提供；流式細(xì)胞儀美國(guó)Coulter公
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