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肉蓯蓉提取物對(duì)帕金森病細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用
作者：王虎, 李文偉, 蔡定芳, 楊茹【關(guān)鍵詞】 肉蓯蓉; 1?甲基?4?苯基?吡啶離子; 帕金森病; 生存率
帕金森�。≒arkinson’s disease, PD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性變性疾病。一旦出現(xiàn)臨床癥狀，其黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺神經(jīng)元已經(jīng)減少了60%～80%。盡管神經(jīng)科學(xué)家采取包括左旋多巴制劑在內(nèi)的各種治療方法，但目前所有的研究都提示無(wú)法阻止其進(jìn)展。生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因153（growth arrest? and DNA damage?induced gene 153, GADD153）是調(diào)控細(xì)胞凋亡的一種重要蛋白，在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激狀態(tài)下大量表達(dá)并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核［1］。本研究觀察了肉蓯蓉提取物對(duì)1?甲基?4?苯基?吡啶離子（1?methyl?4?phenylpyridinium ion, MPP ）介導(dǎo)的SH?SY5Y多巴胺能細(xì)胞系損傷的保護(hù)作用及對(duì)GADD153表達(dá)的影響，并探討了其對(duì)帕金森病的神經(jīng)保護(hù)作用。
1 材料與方法
1.1 材料 肉蓯蓉提取物，上海市東方科技公司產(chǎn)品，PBS稀釋成10 mg/ml，22 μm濾膜過(guò)濾滅菌；MPP ，Sigma公司產(chǎn)品，無(wú)菌蒸餾水稀釋成4 mol/L；胎牛血清、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM）、胰蛋白酶，均為Gibco公司產(chǎn)品；GADD153小鼠抗人單克隆抗體，Santa Cruz公司產(chǎn)品；小鼠抗人β?actin單克隆抗體，Sigma公司產(chǎn)品；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT），荷蘭Duchefa公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（reverse transcriptase?polymerase chain reaction, RT?PCR），MBI公司產(chǎn)品；SH?SY5Y細(xì)胞，復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃芳老師惠贈(zèng)。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SH?SY5Y細(xì)胞每2～3 d用10% DMEM培養(yǎng)液換液1次。待細(xì)胞增長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，按1×105分瓶傳代，置于5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞分為對(duì)照組、MPP 組和肉蓯蓉提取物不同濃度組。用DMEM培養(yǎng)液將MPP 按1∶10梯度稀釋成400 mmol/L，按1∶100體積比例加入96孔板或6孔板中，使MPP 終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4 mmol/L。肉蓯蓉提取物用DMEM培養(yǎng)液按1∶10梯度稀釋成1 mg/ml與10 μg/ml兩個(gè)工作濃度。按1∶100加入96孔板或6孔板中，使終濃度分別為1、10和100 μg/ml。6孔板每孔總體積為2 ml，96孔板每孔總體積為200 μl。每項(xiàng)相同實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性
1.2.2.1 MPP 對(duì)SH?SY5Y細(xì)胞存活率的影響 1×104密度SH?SY5Y細(xì)胞200 μl接種于96孔板，24 h后換含MPP 終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4 mmol/L的培養(yǎng)液，每濃度3復(fù)孔，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育，分別于6、12、24和48 h時(shí)各孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h取出培養(yǎng)板。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）150 μl充分震蕩10 min，待藍(lán)色顆粒完全溶解后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Biorad產(chǎn)品）570 nm處測(cè)定吸光度值。
1.2.2.2 肉蓯蓉提取物對(duì)MPP 介導(dǎo)的SH?SY5Y細(xì)胞損傷的影響 終濃度1 mmol/L MPP 與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100 μg/ml同時(shí)加入96孔板置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h。其余步驟同1.2.2.1。
1.2.3 RT?PCR檢測(cè)GADD153的mRNA表達(dá) 終濃度1 mmol/L MPP 與肉蓯蓉提取物分別為1、 10和100 μg/ml，同時(shí)加入6孔板置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，按Trizol法提取總RNA。取1 μg RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。聚合酶鏈反應(yīng)總體積為25 μl。引物序列為:GADD153上游引物，5’?GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC?3’；下游引物，5’?GTCTACTCCAAGCCTTCCCCCTGCG?3’；β?actin上游引物，5’?ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC?3’；下游引物，5’?TGGCCTTAGGGTTCAGA GGGGC?3’。擴(kuò)增目的產(chǎn)物的長(zhǎng)度分別為422 bp和244 bp。94 ℃預(yù)變性5 min。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃變性0.5 min，60 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物4 μl，電泳后拍照。
1.2.4 Western blotting檢測(cè)GADD153蛋白表達(dá) 終濃度1 mmol/L MPP 與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100 μg/ml，同時(shí)加入6孔板置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，加入60 μl蛋白裂解液裂解，超聲震蕩，100 ℃變性10 min。用Lowry法測(cè)定樣品蛋白濃度。電泳：積層膠60 V 30min，分離膠120 V 90 min；PVDF膜轉(zhuǎn)膜110 V 100 min。加1∶50小鼠抗人GADD153單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜。TBST溶液洗滌3次，10 min/次，加含HRP的兔抗小鼠二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯影X膠片。膠片用Alpha Image 950自動(dòng)掃膠系統(tǒng)得到條帶灰度值。每個(gè)樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的β?actin比較后作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x±s表示。
2 結(jié)果
2.1 MPP 對(duì)SH?SY5Y細(xì)胞存活率的影響 不同濃度MPP 作用SH?SY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞存活率隨MPP 的濃度增加而降低；MPP 1 mmol/L濃度狀態(tài)下細(xì)胞存活率隨時(shí)間增長(zhǎng)而降低。呈現(xiàn)明顯的量效與時(shí)效關(guān)系。見(jiàn)圖1。其中MPP 1 mmol/L組在48 h存活率為（45.30±3.21）%，低于50%。故選用1 mmol/L MPP 作為制作帕金森病細(xì)胞模型的處理劑量。
圖1 不同濃度MPP 對(duì)SH?SY5Y存活率的影響（略）
Figure 1 Effects of different concentrations of MPP on cell viability of SH?SY5Y
2.2
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