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BCP/HAFG-rhBMP-2復(fù)合人工骨修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究
【摘要】 目的 研制理想的能較快修復(fù)大段骨缺損的人工骨材料。 方法 將重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）/透明 質(zhì)酸鈉 纖維蛋白復(fù)合凝膠（HAFG）緩釋體系和多孔雙相鈣磷陶瓷（BCP）結(jié)合研制成BCP/HAFG-rhBMP -2人工骨，并分別將BCP/HAFG-rhBMP -2和BCP/rhBMP-2及BCP/HAFG人工骨進(jìn)行兔橈骨大段骨缺損修復(fù)的對(duì)比研究。術(shù)后分別行大體、放射學(xué)、組織形態(tài)學(xué)及生物力學(xué)測(cè)試。結(jié)果 試驗(yàn)中第12周與第2周相比較，3組堿性磷酸酶（AKP）值下降情況分別為BPC/HAFG-rhBMP-2組降低了65.13%，BPC/BMP-2組降低了71.03%，BPC/HAFG組降低了58.59%。 組織學(xué)及掃描電鏡觀察顯示:12周時(shí)BPC/HAFG-rhBMP-2組材料已基本被成熟骨組織所代替，新骨結(jié)構(gòu)與宿主骨無(wú)差別，而BPC/HAFG和BPC/rhBMP-2組骨小梁結(jié)構(gòu)疏松細(xì)小，材料仍未完全被降解，材料與骨組織間形成較大間隙。術(shù)后12周時(shí)3組材料植入部位骨組織極限抗壓強(qiáng)度分別為:BCP/HAFG-rhBMP-2組（538±12.7） N、BCP/BMP-2組（368±24.0）N、BCP/HAFG組（256±8.4） N。BPC/HAFG-BMP-2復(fù)合型人工骨較BCP/BMP-2及BCP/HAFG人工骨具 有更強(qiáng)、更持久的誘導(dǎo)成骨活性。結(jié)論 BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨能更快促進(jìn)長(zhǎng)骨大段骨缺損的修復(fù)，是一種較理想的人工骨材料。【關(guān)鍵詞】 骨和骨組織;骨移植;生物力學(xué)
為尋找理想的人工骨組織材料，本實(shí)驗(yàn)將多孔雙 相鈣磷陶瓷（BCP）同重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）/透明質(zhì)酸鈉（HA）和纖維蛋白復(fù)合凝膠（HAFG）緩釋體系結(jié)合，制成BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨材料，進(jìn)行修復(fù)長(zhǎng)骨大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)。
1 材料與方法
1.1 人工骨材料的制備
（1）BCP由東南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院生物材 料研究組研制提供。該BCP材料呈白色多孔狀結(jié)構(gòu)， 孔道彼此連通，孔徑約為300 μm，孔隙率為80%。試 驗(yàn)中將BCP制成長(zhǎng)10 mm，直徑4 mm圓柱體。
（2）BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨的制備:在BCP植入前 用特制雙管注射器將混有等量rhBMP-2 的HAFG復(fù)合凝膠緩慢滴注入BCP，使其在BCP表面涂布均勻。待復(fù)合凝膠由流體狀變?yōu)榛野咨脘撔誀顟B(tài)時(shí)植入缺 損部位。同法制備并植入BCP/HAFG人工骨。（3） BCP/rhBMP-2工骨的制備:利用部分真空吸入法［1］將 rhBMP -2和BCP結(jié)合在一起。制成的每支人工骨中約含rhBMP-2 1mg，植入前人工骨在密封包裝下環(huán)氧 乙烷氣體消毒24 h。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
新西蘭兔60只，體重2.5～3.2 kg，雌雄不限。隨機(jī)分為3組:A組為BCP/HAFG-rhBMP-2組;B組為 BPC/rhBMP-2組;C組為BPC/HAFG組。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的戊巴比妥鈉（1ml·kg-1 ）靜脈麻醉后，每兔隨機(jī)選用左右側(cè)前肢，經(jīng)剃毛、消毒，取橈側(cè)切口切開皮膚及皮下組織，顯露橈骨干中段，用單片小鋸鋸下10 mm連帶骨膜骨段，然后按組分別植入相應(yīng)人工骨材料。術(shù)后給予慶大霉素10 000 U·kg-1，每日2次肌肉注射，連續(xù)注射3d。常規(guī)條件下喂養(yǎng) 觀察。
1.4 大體觀察
觀察動(dòng)物的飲食、活動(dòng)、傷口反應(yīng)，術(shù)后第2、4、8、12周分批處死動(dòng)物并取材，觀察植入材料的表面、局部成骨及炎癥反應(yīng)等情況。
1.5 X線觀察
術(shù)后第4、8、12周攝片，由3人盲法按照Lane-sandhu X射線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［2］進(jìn)行評(píng)分。
1.6 堿性磷酸酶（AKP）活性檢測(cè) 術(shù)后第2、4、8、12周3組各取5只動(dòng)物，全麻后，從心臟抽血3 ml離心，使用AKP試劑盒行血清AKP活性測(cè)定。
1.7 橈骨生物力學(xué)檢測(cè)
術(shù)后12周時(shí)，每組各取5個(gè)標(biāo)本及正常橈骨標(biāo)本 作力學(xué)強(qiáng)度測(cè)試。以材料植入處為中心截取橈骨長(zhǎng)約1.4 cm。經(jīng)牙托粉兩端包埋后，置于MTS-858mini bionixII 型生物力學(xué)測(cè)試機(jī)上進(jìn)行垂直壓縮試驗(yàn)。加載速度為1 mm·min-1 ，最大位移設(shè)定3 mm。每隔0.1 s記錄一次數(shù)據(jù)。
1.8 組織病理學(xué)觀察
將每次所獲取的橈骨標(biāo)本作好標(biāo)記置于10%甲醛中固定24 h后，經(jīng)EDTA脫鈣、梯度酒精脫水、石蠟包埋，沿橈骨縱軸連續(xù)切片，厚度為6 μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。
1.9 掃描電鏡觀察
于術(shù)后第2、4、8、12周每組各取3個(gè)標(biāo)本，2.5%戊二醛（pH 7.2～7.4）固定2 h，然后用PBS緩沖液沖洗2次，1%鋨酸PBS液固定2h，再用PBS緩沖液沖洗2次，乙腈逐級(jí)脫水，真空干燥，表面離子濺射噴金處理，HITACHIS-520掃描電鏡下觀察標(biāo)本的超微結(jié)構(gòu)。
2.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包，每組測(cè)得的X線評(píng) 分、AKP水平及生物力學(xué)評(píng)分采用方差及SNK分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平為 α =0.05。
2 結(jié) 果
2.1 大體觀察
術(shù)后動(dòng)物前肢不能負(fù)重，跛行，術(shù)后1周恢復(fù)正常活動(dòng)。所有動(dòng)物切口均Ⅰ期愈合。術(shù)后2周時(shí)，A、B 組材料植入?yún)^(qū)有明顯骨痂生成，而C組材料外周為纖維結(jié)締組織包裹。術(shù)后8周，A組材料已部分降解，新生骨組織的形成量明顯高于B、C組。12周A組骨缺損完全修復(fù)，而其他組骨缺損處仍可見到未吸收的材料及骨缺損（圖1）。
BCP/ HAFG-rhBMP-2組骨缺損完全修復(fù)，骨皮質(zhì)塑形良好（左）;BPC/HAFG組材料未完全降解，缺損部分修復(fù)（中）;BCP/ rhBMP-2組骨缺損大部分 愈合，仍可見少量未降解材料（右）
2.2 組織學(xué)觀察結(jié)果
術(shù)后2周時(shí)，A、B組材料外周新骨開始形成，材料與新骨直接結(jié)合，材料內(nèi)部孔隙中有纖維結(jié)締組織 間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入（圖2）。C組材料外周為纖維結(jié)締組織包裹，偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，材料內(nèi)部可見纖維結(jié)締組織填充。術(shù)后4周，各組骨缺損植入體孔隙中均有軟骨細(xì)胞生成，其中A組軟骨細(xì)胞量明顯高于B、C
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