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瘢痕成纖維細胞的鈣網蛋白表達研究
目的 觀察鈣網蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮膚成纖維細胞內的表達情況。方法 采用免疫細胞化學染色和原位ELISA技術對體外培養(yǎng)的瘢痕及正常皮膚成纖維細胞進行CRT分布定位及表達水平研究。結果 瘢痕和正常皮膚成纖維細胞在處于增殖生長狀態(tài)時，胞漿及核內均有不同程度的CRT表達，其中瘢痕成纖維細胞表達CRT水平(A:1.97±0.15,ELISA492nm)明顯高于正常皮膚成纖維細胞水平(A:1.43±0.12),差異有非常顯著意義(P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮膚成纖維細胞內則均無CRT表達。結論 瘢痕成纖維細胞內CRT的豐富表達對促進細胞遷移、信號傳遞及鈣存儲等方面均有著積極作用。Studyontheexpressionofcalreticulininhypertrophicscar-derivedfibroblasts
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionlevelandintracellulardistributionofcalreticulin(CRT)inhypertrophicscar-derivedfibroblasts(HSF)andnormalskin-derivedfibroblasts(NSF).MethodsUsinganti-CRTantibody,CRTwasdetectedinHSFandNSFbyimmunocytochemistryandELISAtechnique.ResultsCRTwaspresentinthecytoplasmandnucleiinproliferatingHSForNSFinculture,butHSFpossessedsignificantlyhigherexpressionlevelofCRTthanNSF(P＜0.01).Whenthesecells(HSFandNSF)werefused,neitherintracellularnorintranuclearstainingforCRTwasobserved.ConclusionInHSFandNSF,thedistributionofCRTiswidespread.BecauseofitsabundantexpressioninHSF,wepostulatethatCRTasamultifunctionalproteinplaysanimportantroleinCa2 sequestering,integrin-mediatedsignallingandcelladhesion.
【Keywords】HypertrophicscarFibroblastCalreticulinExpression
增生性瘢痕(Hypertrophicscar,HS)作為創(chuàng)傷及外科手術后常見且十分棘手的皮膚組織疾病，瘢痕組織內成纖維細胞異�；罨图毎忾g質過度沉積既是HS的重要組織學特征，也是HS發(fā)生、發(fā)展的物質基礎。鈣網蛋白(Calreticulin,CRT)最早是作為一種存在于非肌細胞內質網上的主要鈣結合蛋白得以認識的［1］，近幾年的研究發(fā)現：除具有鈣離子儲藏作用外，CRT在參與并調節(jié)眾多細胞生物學活性功能上有著積極影響［2-5］，同時它還作為自身抗原在某些免疫性疾病的發(fā)病機制中有著極其重要的價值［6］。我們通過CRT抗體并利用原位ELISA及免疫細胞化學染色技術檢測瘢痕成纖維細胞體外表達CRT水平，輔以正常皮膚成纖維細胞作對照，探討CRT在瘢痕成纖維細胞發(fā)揮異常生物學活性功能中的作用。
1 材料與方法
1.1 組織標本
增生性瘢痕及正常皮膚組織標本均取自住院病人，年齡17～40歲�；颊咴谌吮厩盁o長時間外用各種防治增生性瘢痕藥物史，不伴腫瘤及其他嚴重疾患；瘢痕組織生長時間均在6～9個月之間。
1.2 主要試劑及物品準備
羊抗CRT抗體：Michalak博士惠贈。辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。細胞培養(yǎng)基：DMEM添加10%小牛血清(上海華美生物技術有限公司)。96孔塑料培養(yǎng)板及100mm培養(yǎng)皿(丹麥Nunc公司)。
1.3 成纖維細胞培養(yǎng)
手術切取增生性瘢痕及正常皮膚組織，去皮下脂肪，0.01%新潔爾滅浸洗10min，PBS洗3次，用組織剪將組織剪成細小碎塊并接種于培養(yǎng)皿內，加少量10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃5%CO2靜止培養(yǎng)，3天后補充少量培養(yǎng)劑，隔2天換液，見有細胞從組織塊爬出生長后每天換液，傳代。
1.4 CRT免疫細胞化學染色
體外培養(yǎng)的成纖維細胞去培養(yǎng)基后，PBS輕洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%雙氧水反應5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗體37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反應1h，DAB顯色；顯微鏡下觀察顯色信號。
1.5 CRT原位ELISA檢測［7］
選擇第5代培養(yǎng)細胞為實驗對象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞，調整細胞濃度至106/ml，每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板內。培養(yǎng)16h
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