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研究地榆提取物的抗氧化與抗過(guò)敏作用及其相關(guān)性
摘要: 目的研究地榆提取物的抗氧化與抗過(guò)敏作用及其相關(guān)性。方法地榆經(jīng)乙醇提取，有機(jī)溶劑萃取，大孔樹(shù)脂HP-20分離純化，獲得不同提取部分。采用透明質(zhì)酸酶抑制率及對(duì)DPPH、羥基自由基、過(guò)氧化氫的清除作用來(lái)檢測(cè)提取物活性。結(jié)果地榆大孔樹(shù)脂40%乙醇洗脫物透明質(zhì)酸酶的抑制率與各自由基清除率是所有提取物中最高的，其自由基清除率接近于原花青素和蘆丁，大于維生素C和兒茶素；地榆的提取物濃度與透明質(zhì)酸酶抑制率、氧自由基清除作用成正相關(guān)性。結(jié)論地榆是一種值得開(kāi)發(fā)的抗過(guò)敏、抗氧化植物；地榆提取物的抗過(guò)敏機(jī)制與其具有較強(qiáng)的氧自由基清除作用有關(guān)。
關(guān)鍵詞: 地榆 抗氧化 抗過(guò)敏
地榆Sanguisorba officinalis L.是薔薇科(Rosaceae)地榆屬Sanguisorba L.植物的根及根狀莖,具有涼血止血，解毒斂瘡功效。主要分布于中國(guó)東北 、華北 、西北 、華東 、中南及廣西 ，廣布于歐洲和亞洲北溫帶，主要成分為鞣質(zhì)和三萜皂苷。研究表明地榆提取物能對(duì)抗ONOO-的腎損害作用，抑制細(xì)胞凋亡，改善氧化應(yīng)激和氧化損傷作用［1～3］。國(guó)外Katsumata［4］報(bào)道抗氧化劑可以有效治療過(guò)敏性疾病，因?yàn)榛钚匝跞绯蹶庪x子自由基、羥自由基促使肥大細(xì)胞釋放組胺，產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，因此，從地榆的成分以及抗炎癥、抗氧化的效果看，地榆可能是良好的抗過(guò)敏植物來(lái)源。
但是從目前的文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，地榆的抗過(guò)敏研究報(bào)道較少，主要集中在地榆的粗提物上，如地榆水提液可以明顯使實(shí)驗(yàn)小鼠增強(qiáng)2，4-二硝基氯苯所致遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)，使鼠耳重量增加，具免疫增強(qiáng)作用［5］。地榆根的粗提物能夠抑制組胺介質(zhì)的釋放和TNF-α的產(chǎn)生，具有良好治療即時(shí)型過(guò)敏的效果［6］。雖然Park KH通過(guò)老鼠的被動(dòng)皮膚測(cè)試及由compound 48/80 和Ca2 引發(fā)的過(guò)敏測(cè)試，表明了地榆對(duì)肥大細(xì)胞的抑制作用，其主要作用成分為5-O－α-D-(3-C－羥甲基) 呋喃來(lái)蘇糖基－β－D－（2-羥甲基）阿拉伯呋喃糖的雙糖［7］，但沒(méi)有更多的報(bào)道過(guò)抗過(guò)敏的有效成分。鑒于純天然植物的安全無(wú)副作用以及地榆的研究現(xiàn)狀，本文對(duì)地榆的粗提物進(jìn)行了初步分離，探討地榆提取物的抗氧化與抑制透明質(zhì)酸酶間的作用和內(nèi)在的關(guān)系，為抗過(guò)敏植物資源的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與儀器
1.1 試劑透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸酶，Sigma公司產(chǎn)品；對(duì)-二甲氨基苯甲醛（AR），上海試劑二廠產(chǎn)品；乙酰丙酮，天津試劑廠產(chǎn)品；鄰二氮菲，北京愛(ài)芳醫(yī)藥化工研制公司產(chǎn)品；過(guò)氧化氫，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上�；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；三(羥甲基)氨基甲烷，成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品。
1.2 材料地榆，購(gòu)于南寧市國(guó)人大藥房。
1.3 儀器大孔樹(shù)脂HP-20，北京綠百草公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，日本島津產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，北京市醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；微量移液器，上海精密儀器廠產(chǎn)品；冷凍液循環(huán)泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥系統(tǒng)，美國(guó)LABCONCO公司產(chǎn)品。
2 方法
2.1 提取分離方法取地榆500 g，采用60%乙醇,70℃提取，冷凍干燥得到粗提物A，粗提物依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，并分別冷凍干燥得到樣B，樣C，樣D，以及萃余物水相E組分；用大孔樹(shù)脂HP-20對(duì)樣E進(jìn)行分離,洗脫體積均為2 BV,流速:1 BV/h,長(zhǎng)徑比:12∶1，收集水、10%乙醇、40%乙醇和70%乙醇4部分的洗脫液， 冷凍濃縮干燥分別得到樣F，樣G，樣H，樣I 4個(gè)樣品。
2.2 透明質(zhì)酸酶抑制率實(shí)驗(yàn)抗過(guò)敏活性檢測(cè)：Elson-Morgan 改良法［8］的方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算各個(gè)樣品的抑制率。
2.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)
2.3.1 羥基自由基的測(cè)定［9］將樣品配成濃度為0.4 mg·ml-1的溶液，取3只試管，分別加入2 ml pH=7.4的磷酸鹽緩沖液，1 ml 1.5mmol·L-1的鄰二氮菲溶液，充分混勻后，再加入1 ml 1.5mmol·L-1 FeSO4溶液，每加1管立即混勻，然后向其中1支試管加入1 ml的溶液（每次所加的體積不同），混勻。另兩支試管分別為損傷管和未損傷管，
不加洗脫溶液，再分別加入0.02%的H2O2 1 ml，未損傷管不加H2O2，最后補(bǔ)充各管體積至8 ml。于37℃下保溫1 h，測(cè)在510 nm下的吸光度，重復(fù)兩次，計(jì)算其平均值。
OH的清除率（%）=［（A2-A1）/（A0-A1）］×100%
A0：未損傷管的吸光度；A1：損傷管的吸光度；A2：加樣品并扣除樣品空白后的吸光度。
2.3.2 過(guò)氧化氫清除實(shí)驗(yàn)［10］清除過(guò)氧化氫能力的測(cè)定按文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)，以pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制10 mmol·L-1H202溶液，取5 ml上述溶液加入5 ml樣品液（0.4 mg·ml-1），混勻后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在230 nm處的吸光值A(chǔ)1，實(shí)驗(yàn)中以不加樣品液的H2O2溶液吸光值為A0，以不加H2O2溶液的樣品溶液的吸光值為A2。
過(guò)氧化氫的清除率(％)=［A0-(A1-A2)］／A0×100%
2.3.3 DPPH清除實(shí)驗(yàn)［11］分別取2 ml不同濃度的試樣液于試管中，加入 2×10-4mol·L-1的DPPH· 溶液2 ml，混合均勻，反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定其吸光度，同時(shí)測(cè)定試樣空白以及不加試樣液的空白樣的吸光度。按下式計(jì)算其對(duì)DPPH· 抑制率：
DPPH·清除率（%）=［1－（A1－A2）/A0］× 100% 式中：A1=2 ml DPPH· 溶液 2 ml試樣液的吸光度；A2=2 ml試樣液 2 ml無(wú)水乙醇的吸光度； A0=2 ml DPPH· 溶液 2 ml無(wú)水乙醇的吸光度。
3 結(jié)果
3.1 各提取物的透明質(zhì)酸酶抑制率原花青素、兒茶素都具有強(qiáng)有力的抗氧化作用，抗過(guò)敏作用。從表1可以看出，樣A經(jīng)溶劑萃取后得到樣E，樣E經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后得樣H，其透明質(zhì)酸酶的抑制率分別為47.70%，62.00%，76.00%，逐步升高。樣H的活性超過(guò)兒茶素，且提取率相對(duì)于其他樣品是較高的，因此選擇A，E，H作為下面抗過(guò)敏與抗氧化作用量效分析的樣品。從羥基自由基清除率與過(guò)氧化氫清除率來(lái)看，樣H的清除率是所有提取物最高的，其自由基清除率接近于原花青素和蘆丁，大于維生素C和兒茶素；過(guò)氧化氫清除率接近于原花青素，大于蘆丁、維生素C、兒茶素。因此，樣H在本實(shí)驗(yàn)中顯示了與原花青素相近的活性。
本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品H進(jìn)行了試管預(yù)測(cè)：①樣品H可以使明膠溶液產(chǎn)生沉
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