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探討體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞方法
摘要: 目的： 研究如何提高體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞（hPDL）的成功率，為簡便、快速地獲得大量成活率高的hPDL膜細(xì)胞，建立體外細(xì)胞模型提供一定的實驗方法。方法： 利用3種不同方法（組織塊法、酶消化組織塊法、全牙消化法）進(jìn)行牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)，用形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色等方法鑒定細(xì)胞來源；通過生長曲線的測定研究體外細(xì)胞生長特性。結(jié)果： 3種方法獲得的細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)行為大致相同；波絲蛋白抗體染色陽性，角蛋白抗體染色陰性。組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞同源性好，但初代培養(yǎng)時間長；全牙消化法的原代培養(yǎng)成功率高于其他2種方法。結(jié)論： 通過對牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)方法的改良，可以顯著提高h(yuǎn)PDL原代培養(yǎng)的成功率。
關(guān)鍵詞: 牙周膜； 細(xì)胞培養(yǎng)； 免疫組織化學(xué)
細(xì)胞體外分離培養(yǎng)是研究復(fù)雜的生物系統(tǒng)的重要手段，細(xì)胞培養(yǎng)條件下，將細(xì)胞從復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境轉(zhuǎn)移到較為簡單的體外環(huán)境，可對細(xì)胞學(xué)研究中的變量進(jìn)行分離和控制。上世紀(jì)70年代以來，國外學(xué)者對牙周膜細(xì)胞（Periodontal LigamentCells PDL）分離純化進(jìn)行了大量的探索和研究，且成功地從猴、豬、人等牙周膜分離培養(yǎng)出牙周膜細(xì)胞［1～3］。人牙周膜細(xì)胞（hPDL）分離培養(yǎng)主要有酶消化法和組織貼塊法［4］。國內(nèi)外學(xué)者對這2種方法評價不一，并且在這2種方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)提出了酶消化組織塊法和全牙消化法［5］。對組織塊法、酶消化組織塊法和全牙消化法這3種方法做了一些比較，以尋求hPDL體外培養(yǎng)的最佳方法。
1 材料和方法
1.1 試劑及主要實驗儀器設(shè)備
α-MEM 培養(yǎng)液（Hyclone，USA），膠原酶（Type I，Sigma，USA），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（配成0.25 %,過濾分裝，冷凍保存），青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 mg/L；SABC 免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士德），角蛋白抗體及波絲蛋白抗體（武漢博士德），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡，血球計數(shù)板。
1.2 方法
1.2.1 組織塊法培養(yǎng)hPDL
�。�1）取材：選擇健康青少年（12～18 歲）正畸拔除的健康的雙尖牙，超凈工作臺內(nèi)用刀片仔細(xì)刮除附著牙齦及根尖組織，用 D-Hanks液沖洗 3 次；（2）無菌處理：將牙冠浸入 5.25%次氯酸鈉溶液中 2 min，再用含高濃度雙抗的D-Haks液沖洗2遍。按照司徒鎮(zhèn)強［6］傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)；（3）傳代：細(xì)胞匯合至培養(yǎng)瓶 80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2消化傳代。
1.2.2 酶消化組織塊法培養(yǎng)hPDL
酶消化組織塊法原代培養(yǎng)在取材、無菌處理上與組織塊法相同。刮下根中 2/3 的牙周膜后，不剪，移入離心管內(nèi)。0.1%膠原酶37 ℃消化30 min，其中，每5 min振蕩1次，當(dāng)肉眼觀察到培養(yǎng)液略混濁，顯微鏡下見組織塊松散時，離心，棄上清液，用含血清及雙抗的培養(yǎng)基漂洗1次后棄上清液，收集組織塊，將組織塊平鋪于培養(yǎng)瓶底，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，向內(nèi)加入 4 ml 培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，使組織塊貼壁，再翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；傳代與組織塊法相同。
1.2.3 全牙消化法培養(yǎng)hPDL
全牙消化法原代培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞取材、無菌處理與組織塊法相同。將牙齒放入裝有0.1%膠原酶的青霉素小瓶內(nèi)，牙根向下，使消化液浸沒牙根，37 ℃溫箱內(nèi)消化1 h，用吸管充分吹打牙根表面，加入等量含血清的培養(yǎng)基，離心，棄上清液，加入3 ml培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素 100 U/ml、鏈霉素 100 mg/L）吹打形成細(xì)胞懸液，移入25 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，3 d換液1次，待細(xì)胞鋪至瓶底80%時用0.25%胰蛋白酶1∶2消化傳代。
1.3 細(xì)胞的生長情況觀察
1.3.1 倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察細(xì)胞原代和傳代生長情況。
1.3.2 HE染色
取生長狀態(tài)良好的第5代細(xì)胞進(jìn)行爬片，用蘇木精-伊紅染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.3.3 細(xì)胞免疫化學(xué)染色
將培養(yǎng)的第3代hPDL接種于置有蓋玻片的培養(yǎng)瓶中，按常規(guī) SABC 法操作，進(jìn)行波絲蛋白抗體、角蛋白抗體染色，光鏡下觀察染色情況。
1.3.4 描繪細(xì)胞生長曲線
取3塊 24 孔板，分別取3種方法培養(yǎng)的第5代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/ml接種于 24 孔板，每孔100 μl，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后每孔加0.5 ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每天每組各取 3孔的細(xì)胞作細(xì)胞計數(shù)，連續(xù)觀察8 d，繪制細(xì)胞生長曲線。
2 結(jié)果
2.1 形態(tài)學(xué)觀察3種方法培養(yǎng)的hPDL形態(tài)學(xué)上無太大區(qū)別，均呈長梭形或星形，胞突細(xì)長，胞體豐滿，胞漿均勻，中央有圓形或橢圓型的胞核，細(xì)胞呈放射狀、漩渦狀排列（見圖1～3）。HE 染色胞核嗜堿性，胞漿嗜伊紅 （見圖4）。
2.2 免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果免疫組織化學(xué)實驗顯示細(xì)胞波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來源（見圖5、圖6）。
2.3 3種方法培養(yǎng)的hPDL生長情況
2.3.1 組織塊法
牙周膜組織塊經(jīng)靜置貼壁后，一般 8～16 d組織塊邊緣有細(xì)胞開始游出，以組織塊為中心成放射狀、漩渦狀生長，生長的細(xì)胞以1∶2 傳代培養(yǎng)，最初5代的細(xì)胞3～5 d即可長滿培養(yǎng)瓶底，生長狀態(tài)較活躍，核分裂相多見；6～12 代細(xì)胞，7～10 d匯合，細(xì)胞增殖穩(wěn)定。本實驗用組織塊法培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)了20例，成功1例，成功率5%。
2.3.2 酶消化組織塊法
用此方法所培養(yǎng)的20例中，有4例在5～10 d內(nèi)觀察到細(xì)胞游出，2例傳代成功。細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀排列生長。傳代后的細(xì)胞生長旺盛，狀態(tài)良好，原代培養(yǎng)成功率為10%。圖1 組織塊周圍長出的牙周膜
2.3.3 全牙消化法
最初消化下來的細(xì)胞為圓形，呈懸浮狀態(tài)。24 h 后細(xì)胞開始貼壁，48 h 后幾乎全部貼壁。貼壁后的細(xì)胞2～3 d開始伸展變形，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或星形，少數(shù)呈扁平多角形。從第6天起，細(xì)胞生長加速，長梭形及星形細(xì)胞增殖活躍，多角形細(xì)胞生長相對較緩慢，細(xì)胞大約經(jīng)歷12 d后開始形成單層，長梭形細(xì)胞占絕對優(yōu)勢。細(xì)胞傳至 2～3代時可基本去除上皮樣細(xì)胞，4～10 代細(xì)胞生長狀態(tài)較好，核分裂相多見，3～5 d可長滿培養(yǎng)瓶底。用此方法原代培養(yǎng)20例，有4例傳代成功，成功
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