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淺析非病毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的現(xiàn)狀和展望

時(shí)間:2024-06-27 00:06:38 藥學(xué)畢業(yè)論文 我要投稿
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淺析非病毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的現(xiàn)狀和展望

摘要:目前基因治療已經(jīng)成為科學(xué)家治療多種難治性疾病的一種新手段,基因?qū)爰夹g(shù)是基因治療的核心也是最基本的技術(shù)。目前研究較多的基因?qū)爰夹g(shù)共分為兩大類:一,病毒載體基因?qū)敕ǎ欢,非病毒載體基因?qū)敕。前者轉(zhuǎn)染效率高,但存在安全性和免疫原性等問題。因此,近年來人們對非病毒類載體系統(tǒng)給予了更多的關(guān)注。

關(guān)鍵詞: 非病毒載體 基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 現(xiàn)狀和展望

非病毒載體基因轉(zhuǎn)移方法又分為物理方法和化學(xué)方法。物理方法如:注射法、基因槍法、電穿孔法、超聲波法等都是借助物理力量穿透細(xì)胞膜達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的;化學(xué)方法則是借助天然的或者人工合成的化合物輔助完成基因轉(zhuǎn)移。盡管近年來在非病毒基因轉(zhuǎn)移領(lǐng)域中取得了顯著成效,但總體而言,非病毒載體相對于病毒載體來說轉(zhuǎn)移基因的效率要低,在體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移尤其如此,F(xiàn)在把目前較常用的非病毒載體基因轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)勢和局限綜述如下。
1 物理方法
就是基于物理力量造成細(xì)胞膜的瞬間缺損,從而使質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的方法。如基因槍法、電穿孔法、超聲波法等,還有近年來發(fā)現(xiàn)的激光相關(guān)輔助方法。
1.1 注射法
直接將質(zhì)粒DNA注射入組織細(xì)胞中達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的。有學(xué)者成功地將裸露的質(zhì)粒DNA注射入肌肉、肝臟[1]、皮膚[2]等組織,但基因表達(dá)水平較低。注射法中,細(xì)胞表面的某些受體起了一定的作用,它們能夠特異或者非特異性地結(jié)合DNA并且介導(dǎo)DNA的內(nèi)吞,但這些受體的詳細(xì)作用機(jī)制不甚清楚。由于注射法有其獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)如:方法簡單,不需特殊試劑且毒性低而受到歡迎。此外,借助顯微操作系統(tǒng)進(jìn)行的顯微注射法是目前國際上公認(rèn)的制備轉(zhuǎn)基因和基因剔除動物模型的首選。
1.2 基因槍法
基因槍法是一種全新的基因?qū)爰夹g(shù),它以壓縮氣體(氦或氮)轉(zhuǎn)換成的氣體沖擊波為動力,把附著于高速微彈上的DNA直接射入細(xì)胞、組織和細(xì)胞器,基因槍導(dǎo)入的基因被證明可在廣泛類型的細(xì)胞中得到瞬時(shí)的、高效率的表達(dá);驑尫ㄊ瞧つw、黏膜以及手術(shù)局部暴露組織較理想的基因轉(zhuǎn)移方法,因而基因槍被認(rèn)為是將來DNA疫苗的良好免疫工具。但是基因槍法用于基因治療還需要進(jìn)一步改進(jìn),如通過對微彈顆粒表面結(jié)構(gòu)的改良使其可以結(jié)合更多的DNA或者使結(jié)合更緊密;通過對氣體沖擊波壓力的調(diào)節(jié)來調(diào)控微彈的運(yùn)動軌跡等。
1.3 電穿孔法
通過短暫的高強(qiáng)度的電場作用,瞬時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性,從而將周圍介質(zhì)中的外源核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。電穿孔法是一種既可以用于體外也可以用于體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移方法。理論上任何可以插入兩個(gè)電極的組織器官都可以用電穿孔法導(dǎo)入外源基因,然而目前體內(nèi)用電穿孔法導(dǎo)入基因主要用于皮膚和肌肉組織。100KD的DNA被報(bào)道可以利用電穿孔的方法成功導(dǎo)入肌肉組織中[3]。電穿孔導(dǎo)入的外源基因也有被報(bào)道長期穩(wěn)定表達(dá)超過1年時(shí)間[4]。本課題組前期工作中利用電穿孔法將質(zhì)粒pGFP?N2導(dǎo)入白血病細(xì)胞株K562中后,經(jīng)過篩選培養(yǎng),最終表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞高達(dá)90%以上,穩(wěn)定表達(dá)時(shí)間在半年以上[5]。該方法轉(zhuǎn)移基因時(shí),DNA的濃度以及DNA在組織中的分布對電穿孔的效率至關(guān)重要。用電穿孔法進(jìn)行體內(nèi)基因?qū)霑r(shí)存在如下局限:①兩個(gè)電極的距離不能超過1cm,這樣就很難實(shí)現(xiàn)大面積的細(xì)胞同時(shí)基因轉(zhuǎn)移;②如果是內(nèi)臟的基因?qū)耄仨毥柚饪剖中g(shù)放置電極,損傷較大;③該法所用的電壓較高,容易導(dǎo)致局部組織細(xì)胞被電灼傷。此外,較高電壓作用于細(xì)胞后可能會影響細(xì)胞自身基因組DNA的穩(wěn)定性。以上局限性有望通過對電極的優(yōu)化及電場強(qiáng)度的調(diào)節(jié)而減少到最低。值得一提的是現(xiàn)在出現(xiàn)了類似于傳統(tǒng)電穿孔法的細(xì)胞核轉(zhuǎn)染法,借助細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀,采用獨(dú)特的電場參數(shù)與細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)染溶液相結(jié)合的方法,將細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率大大的提高,而細(xì)胞的死亡率則大大的降低。轉(zhuǎn)染條件對于不同的細(xì)胞不需要摸索和優(yōu)化,而且絕大多數(shù)細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后4h就可以見到轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。
1.4 超聲波法
超聲波在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域分為診斷性超聲和治療性超聲。治療性超聲常用于組織深部加熱、緩解局部疼痛和促進(jìn)炎癥吸收等。超聲在一定的波長和強(qiáng)度下能增加血管和細(xì)胞膜的通透性,尤其有利于全身用藥和轉(zhuǎn)基因時(shí)藥物和DNA在局部組織細(xì)胞的定位。超聲波法比單純DNA注射法的基因轉(zhuǎn)移效率要高10~20倍。該法用于基因轉(zhuǎn)移的效率受諸多因素影響:如超聲波的頻率、強(qiáng)度和作用時(shí)間以及所用質(zhì)粒DNA的量等。此外,由于造影劑在超聲波作用下變?yōu)檠杆贁U(kuò)張和縮小的含氣泡沫,從而在局部產(chǎn)生波動,使臨近細(xì)胞膜通透性瞬間增加,所以造影劑的使用可以增加超聲波的基因轉(zhuǎn)移效率。與電穿孔不同,超聲波作用后細(xì)胞膜出現(xiàn)微孔,基因通過自由擴(kuò)散的方式通過微孔進(jìn)入細(xì)胞,因而質(zhì)粒DNA的大小及濃度對基因轉(zhuǎn)移效率影響較大。超聲波用于體內(nèi)組織器官基因?qū)氲膬?yōu)勢在于其為一種無創(chuàng)的基因轉(zhuǎn)移方法。然而到目前為止,超聲波用于基因轉(zhuǎn)移的主要局限在于其效率較低。
2 化學(xué)方法
目前非病毒載體基因轉(zhuǎn)移方法中研究最熱門的還是陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,攜帶目的基因的陽離子脂質(zhì)體或聚合物通過細(xì)胞吞噬或吞飲作用進(jìn)入靶細(xì)胞中,一部分目的基因?qū)⒃诎麧{中被釋放出來并轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核發(fā)揮作用。
2.1 陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移
自從Felgner等科學(xué)家[6]于1987年首次發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體具有轉(zhuǎn)移基因的作用后,大量的陽離子脂質(zhì)體被改良后用于基因的轉(zhuǎn)移。這些脂質(zhì)體主要區(qū)別在于它們所帶電荷及細(xì)微結(jié)構(gòu)的不同。盡管有部分脂質(zhì)單獨(dú)就可以形成囊泡發(fā)揮較好的基因轉(zhuǎn)移作用,但很多陽離子脂質(zhì)需要磷脂或者膽固醇輔助作用下才能形成脂質(zhì)體囊泡。當(dāng)把目的DNA與這種脂質(zhì)體混合后,DNA就會濃縮并與之形成較穩(wěn)定的脂質(zhì)體DNA復(fù)合物(lipoplex)。由于脂質(zhì)體具有類似生物膜的性質(zhì),因此當(dāng)脂質(zhì)體DNA復(fù)合物與細(xì)胞膜接觸后,通過胞吞作用而進(jìn)入胞內(nèi)。如今不斷改良的陽離子脂質(zhì)體試劑在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以及難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系應(yīng)用中都表現(xiàn)出超乎尋常的效果。此外,脂質(zhì)體沒有免疫原性,細(xì)胞毒性小,而且也易于制備,因此陽離子脂質(zhì)體已成為現(xiàn)今用于基因轉(zhuǎn)移的最常用方法之一。
為了達(dá)到特異性基因轉(zhuǎn)移的目的,科學(xué)家們相繼開發(fā)了免疫脂質(zhì)體和配體脂質(zhì)體[7]。免疫脂質(zhì)體或配體脂質(zhì)體的靶向技術(shù)是通過將脂質(zhì)體與單克隆抗體或配體共價(jià)結(jié)合成免疫脂質(zhì)體或配體脂質(zhì)

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