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PI-103對(duì)多藥耐藥白血病細(xì)胞體外作用的研究
【摘要】 目的 研究PI-103對(duì)耐藥白血病細(xì)胞的效果及其機(jī)制。方法 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法研究PI-103對(duì)K562及K562/A02細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)研究細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的改變。結(jié)果 PI-103能顯著抑制兩種細(xì)胞株的生長(zhǎng)，對(duì)敏感和耐藥白血病細(xì)胞株具有相同的抑制效果；PI-103能顯著增加細(xì)胞內(nèi)阿霉素的濃度，與阿霉素聯(lián)用時(shí)，能增加阿霉素對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，但僅有疊加效應(yīng)而無(wú)協(xié)同效應(yīng)。結(jié)論 PI-103對(duì)于耐藥白血病是一種有良好應(yīng)用前景的藥物。
【關(guān)鍵詞】 白血病 多藥耐藥 PI-103
多藥耐藥是急性白血病治療失敗的主要原因，其主要機(jī)制是P-糖蛋白（Pgp）高表達(dá)，將細(xì)胞內(nèi)的化療藥物“泵”出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度過(guò)低，使白血病細(xì)胞呈現(xiàn)出耐藥表型。如何繞過(guò)Pgp的泵作用，逆轉(zhuǎn)耐藥，提高白血病的治療效果是當(dāng)前治療的重要方向。K562/A02是由K562細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)期阿霉素誘導(dǎo)和克隆篩選而建立的一個(gè)耐藥細(xì)胞系[1]，能在2μg/ml阿霉素中長(zhǎng)期生存，對(duì)阿霉素的耐藥指數(shù)在10以上。它高表達(dá)Pgp，是體外研究多藥耐藥的一個(gè)較好的細(xì)胞模型。
PI-103是一種人工合成的PI3K和mTOR特異性抑制劑。PI3K和mTOR是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要成員，該信號(hào)途徑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PI-103對(duì)黑色素瘤[2]、肺癌[3]、神經(jīng)腫瘤[4]等多種腫瘤具有抑制作用，顯示了較好的抗腫瘤效果。本研究旨在研究它對(duì)多藥耐藥白血病細(xì)胞株K562/A02的作用。
1 材料和方法
1.1細(xì)胞株及培養(yǎng)條件 K562及K562/A02細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液病研究所傳代保存。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640（Gibco公司產(chǎn)品），置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，K562/A02長(zhǎng)期以2μg/ml阿霉素（ADM）加壓培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)前2周撤除阿霉素。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PI-103購(gòu)自美國(guó)cayman公司。
1.2MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度接種于96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度藥物，空白對(duì)照組以培養(yǎng)基補(bǔ)足，每孔總體系0.2ml，CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)（h），加MTT工作液20μl/孔（美國(guó)Sigma公司），置CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，1000 rpm/min離心，小心吸去上清，加入二甲基亞砜0.2ml/孔，吹打，使紫藍(lán)色甲臜沉淀充分溶解。在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值（A）。以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，設(shè)復(fù)孔三個(gè)，取平均值為最終結(jié)果。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：
細(xì)胞生存率=（A處理組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）*100%
細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-細(xì)胞生存率
1.3流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度：將0.2μM的PI-103和/或2μg/ml阿霉素與終濃度為1×105/ml的細(xì)胞共同孵育24小時(shí)，收集1～5×105個(gè)細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清。加入適量冷PBS，細(xì)胞重懸，1000rpm離心5min，重復(fù)2次。以冷PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)行流式細(xì)胞檢測(cè)。流式檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488nm，接收波長(zhǎng)575nm。細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度高低以熒光強(qiáng)度為計(jì)量單位。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。
2 結(jié)果
2.1 PI-103對(duì)敏感和耐藥細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用相同
我們用MTT法檢測(cè)了不同濃度PI-103對(duì)K562及K562/A02細(xì)胞增殖的抑制作用。0.5-5μM的PI-103處理24h后，兩種細(xì)胞均呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)受抑。而且，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈現(xiàn)出劑量依賴性。此外，在相同濃度的PI-103作用下，兩種細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制率基本相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。
2.2 PI-103能增加白血病細(xì)胞株對(duì)阿霉素的敏感性，但僅有疊加作用
為進(jìn)一步了解PI-103與阿霉素是否具有協(xié)同抑制白血病細(xì)胞增殖作用，我們用0.2μM PI-103與不同濃度阿霉素聯(lián)合作用于K562細(xì)胞及K562/A02細(xì)胞，以MTT法觀察了藥物聯(lián)用對(duì)兩細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果。結(jié)果顯示，0.2μM PI-103對(duì)K562及K562/A02細(xì)胞的抑制率分別為10.5%和16.4%，加用PI-103后，阿霉素對(duì)K562細(xì)胞的抑制率有所增加，但單用阿霉素組的生長(zhǎng)抑制曲線與聯(lián)用PI-103組的生長(zhǎng)抑制曲線幾乎平行，說(shuō)明PI-103聯(lián)用阿霉素僅有疊加作用，而無(wú)協(xié)調(diào)作用。同樣，在K562/A02組，但單用阿霉素組的生長(zhǎng)抑制曲線與聯(lián)用PI-103組的生長(zhǎng)抑制曲線幾乎平行。說(shuō)明PI-103聯(lián)用阿霉素對(duì)K562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用也僅有疊加作用，而無(wú)協(xié)同作用。
2.3 PI-103能增加耐藥細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)阿霉素的濃度
為明確PI-103增加細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)阿霉素的濃度。
結(jié)果顯示，在K562組，未用PI-103時(shí)，細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度為87.46±3.46，PI-103處理后，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度升高為107.31±6.13，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015）。而在K562/A02組，PI-103使細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度由79.09±2.97升高至165.94±6.58，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。結(jié)果顯示PI-103能顯著增加細(xì)胞內(nèi)阿霉素的濃度，尤其是在耐藥K562/A02細(xì)胞中更明顯。
3 討論
PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞生存和增殖的重要途徑，在白血病多藥耐藥的形成機(jī)制中也發(fā)揮了重要作用。因而，通過(guò)抑制PI3K途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到治療白血病尤其是耐藥白血病的目的是一個(gè)較好的治療思路[5]。本研究結(jié)果顯示，雙向抑制劑PI-103能顯著抑制白血病細(xì)胞的增殖，且不受耐藥細(xì)胞表型的影響，在耐藥細(xì)胞及不耐藥細(xì)胞中發(fā)揮同樣的抑制生長(zhǎng)作用。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑是一種有良好應(yīng)用前景的藥物。
本研究發(fā)現(xiàn)，在Pgp高表達(dá)的細(xì)胞株K562/A02中，PI-103能明顯提高細(xì)胞內(nèi)阿霉素的濃度，其增加量明顯高于敏感株K562。其機(jī)制可能是由于Pgp的合成受抑制導(dǎo)致的。Tazzari等報(bào)道[6]，多藥耐藥蛋白P170的表達(dá)是受PI3K/AKT/mTOR信號(hào)調(diào)控的。Pgp合成減少導(dǎo)致阿霉素被“泵”出減少，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度提高，從而在一定程度上逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥。
由PI-103能提高細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度這一結(jié)果，作者推論P(yáng)I-103與阿霉素有聯(lián)用有協(xié)同作用。但令作者感到意外的是，本結(jié)果顯示，二者聯(lián)用僅有疊加作用，而無(wú)協(xié)同作用。這可能與下列原因有關(guān)：首先，可能與實(shí)驗(yàn)方法的選擇有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法研究藥物作用后細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示，在2μg/ml阿霉素作用下，K562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)顯著被抑制。然而，K562/A02細(xì)胞是長(zhǎng)期用含2μg/ml的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的，僅在實(shí)驗(yàn)前2周開(kāi)始撤除阿霉素培養(yǎng)，因而，該細(xì)胞在2μg/ml阿霉素作用下是不會(huì)死亡的，只是細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢了，細(xì)胞并未發(fā)生凋亡。聯(lián)用PI-103后，盡管K562/A02細(xì)胞的生長(zhǎng)受抑率僅僅是兩藥的疊加，但細(xì)胞凋亡是否有增加，尚不明確，換用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率也許有助于得出更確切的結(jié)論。其次，是否有其他耐藥機(jī)制的參與，拮抗了細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度提高所致的殺細(xì)胞效應(yīng)，尚有待進(jìn)一步的研究。第三，與K562/A02細(xì)胞的特性有關(guān)。Kojima等[7]發(fā)現(xiàn)，在野生型P53存在的白血病細(xì)胞中，PI-103與阿霉素有協(xié)同作用，而在P53突變的白血病細(xì)胞，則無(wú)協(xié)同效果。以往研究顯示，K562細(xì)胞存在P53突變，因而，PI-103和阿霉素在K562及其耐藥株K562/A02中無(wú)協(xié)同殺傷白血病細(xì)胞的作用。然而，多數(shù)白血病原代細(xì)胞不存在P53突變。因而，體內(nèi)應(yīng)用于病人時(shí)，PI-103可能會(huì)與阿霉素產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。
總之，在體外，PI-103具有抗白血病細(xì)胞作用，對(duì)敏感和耐藥細(xì)胞同樣有效；它能增加細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度，增加細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。雙效PI3K/AKT/mTOR抑制劑是一種有良好應(yīng)用前景的藥物，對(duì)PI-103的深入研究，必將為開(kāi)發(fā)研制新的雙效PI3K/AKT/mTOR抑制劑奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
參 考 文 獻(xiàn)
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