- 相關(guān)推薦
蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析研究進(jìn)展
摘 要： 隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，運(yùn)用質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析日益增多，本文簡要綜述了肽和蛋白質(zhì)等生物大分子質(zhì)譜分析的特點(diǎn)、方法及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的原理、方式和應(yīng)用，并對其發(fā)展前景作出展望。
關(guān)鍵詞： 蛋白質(zhì)，質(zhì)譜分析，應(yīng)用
前言：
蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細(xì)胞，約占細(xì)胞干質(zhì)量的50%以上， 作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關(guān)重要的作用，因此蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為重要的研究對象。關(guān)于蛋白質(zhì)的分析研究，一直是化學(xué)家及生物學(xué)家極為關(guān)注的問題，其研究的內(nèi)容主要包括分子量測定，氨基酸鑒定，蛋白質(zhì)序列分析及立體化學(xué)分析等。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，儀器分析手段的更新，尤其是質(zhì)譜分析技術(shù)的不斷成熟，使這一領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速。
自約翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)發(fā)明了對生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的方法及發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析法以來，隨著生命科學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物質(zhì)譜目前已成為有機(jī)質(zhì)譜中最活躍、最富生命力的前沿研究領(lǐng)域之一[1]。它的發(fā)展強(qiáng)有力地推動了人類基因組計(jì)劃及其后基因組計(jì)劃的提前完成和有力實(shí)施。質(zhì)譜法已成為研究生物大分子特別是蛋白質(zhì)研究的主要支撐技術(shù)之一，在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的研究中占據(jù)了重要地位[2]。
1．質(zhì)譜分析的特點(diǎn)
質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點(diǎn)：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測定，同時(shí)具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性。
2．質(zhì)譜分析的方法
近年來涌現(xiàn)出較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：1)電噴霧電離質(zhì)譜；2)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜；3)快原子轟擊質(zhì)譜；4)離子噴霧電離質(zhì)譜；5)大氣壓電離質(zhì)譜。在這些軟電離技術(shù)中，以前面三種近年來研究得最多，應(yīng)用得也最廣泛[3]。
3．蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析
蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復(fù)雜結(jié)構(gòu)主要包括以肽鏈為基礎(chǔ)的肽鏈線型序列[稱為一級結(jié)構(gòu)]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱為二級，三級或四級]結(jié)構(gòu)。目前質(zhì)譜主要測定蛋自質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置。
3.1蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析原理
以往質(zhì)譜(ＭＳ)僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的Ｍ/Ｚ值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。
3.2蛋白質(zhì)和肽的序列分析
現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)越來越多的小肽同蛋白質(zhì)一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質(zhì)序列測定方法支持這些研究的進(jìn)行�，F(xiàn)有的肽和蛋白質(zhì)測序方法包括Ｎ末端序列測定的化學(xué)方法Edman法、Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化學(xué)降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質(zhì)序列測定標(biāo)準(zhǔn)方法的Ｎ末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(50個(gè)氨基酸殘基/天)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯(cuò)誤識別，而對Ｎ末端保護(hù)的肽鏈則無法測序[4]。Ｃ末端化學(xué)降解測序法則由于無法找到PITC這樣理想的化學(xué)探針，其發(fā)展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜由于很高的靈敏度、準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學(xué)家的廣泛注意。在質(zhì)譜測序中，靈敏度及準(zhǔn)確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對象進(jìn)行的。近年來隨著電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionisation，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測限下降到fmol級別，可測定分子量范圍則高達(dá)100000Da，目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI TOF MS)已成為測定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級結(jié)構(gòu)的有效工具，也是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中重大課題——蛋白質(zhì)組研究所必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一 [5] 。目前在歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室(EMBL)及美國、瑞士等國的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(序列)譜庫，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結(jié)果提供可靠的依據(jù)[6]。
3.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方式
質(zhì)譜用于肽和蛋白質(zhì)的序列測定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫，搜索與之相對應(yīng)的已知蛋白，從而獲取待測蛋白序列。將蛋白質(zhì)繪制“肽圖”是一重要測列方法。第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基，其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從Ｎ端或Ｃ端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測序(laddersequencing)，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基。
3.3.1蛋白消化
蛋白的基團(tuán)越大，質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率。一般而言，6-20個(gè)氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測�，F(xiàn)今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會產(chǎn)生相同的多肽。
3.3.2基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測量法(MALDI-TOF MS) [7]
簡而言之，基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測量儀是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號，并依據(jù)質(zhì)量/電荷之比(mass/charge，m/z)來對該多肽進(jìn)行分析，以判斷該多肽源自哪一個(gè)蛋白。待檢樣品與含有在特定波長下吸光的發(fā)光團(tuán)的化學(xué)基質(zhì)(matrix)混合，此樣品混合物隨即滴于一平板或載玻片上進(jìn)行揮發(fā)，樣品混合物殘余水份和溶劑的揮發(fā)使樣品整合于格狀晶體中，樣品然后置于激光離子發(fā)生器(lasersource)。激光作用于樣品混合物，使化學(xué)基質(zhì)吸收光子而被激活。此激活產(chǎn)生的能量作用于多肽，使之由固態(tài)樣品混合物變成氣態(tài)。由于多肽分子傾向于吸收單一光子，故多肽離子帶單一電荷.這些形成的多肽離子直接進(jìn)入飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀(TOFmassanalyzer)。飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀用于測量多肽離子由分析儀的一端飛抵另一端探測器所需要的時(shí)間。而此飛行時(shí)間同多肽離子的質(zhì)量/電荷的比值成反比，即質(zhì)量/電荷之比越高，飛行時(shí)間越短。最后，由電腦軟件將探測器錄得的多肽質(zhì)量/電荷比值同數(shù)據(jù)庫中不同蛋白經(jīng)蛋白酶消化后所形成的特定多肽的質(zhì)量/電荷比值進(jìn)行比較，以鑒定該多肽源自何種蛋白.此法稱為多肽質(zhì)量指紋分析(peptidemassfin-gerprinting)�；|(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測量法操作簡便，敏感度高，同許多蛋白分離方法相匹配，而且，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中有充足的關(guān)于多肽質(zhì)量/電荷比值的數(shù)據(jù)，因此成為許多實(shí)驗(yàn)室的首選蛋白質(zhì)譜鑒定方法。
3.3.3電子噴霧電離質(zhì)譜測量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8 ]
同基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜測量法在固態(tài)下完成不同，電子噴霧電離質(zhì)譜測量法是在液態(tài)下完成，而且多肽離子帶有多個(gè)電荷，由高效液相層析等方法分離的液體多肽混合物，在高壓下經(jīng)過一細(xì)針孔。當(dāng)樣本由針孔射出時(shí)，噴射成霧狀的細(xì)小液滴，這些細(xì)小液滴包含多肽離子及水份等其他雜質(zhì)成分。去除這些雜質(zhì)成分后，多肽離子進(jìn)入連續(xù)質(zhì)量分析儀(tan- demmassanalyzer)，連續(xù)質(zhì)量分析儀選取某一特定質(zhì)量/電荷比值的多肽離子，并以碰撞解離的方式將多肽離子碎裂成不同電離或非電離片段。隨后，依質(zhì)量/電荷比值對電離片段進(jìn)行分析并匯集成離子譜(ionspectrum)，通過數(shù)據(jù)庫檢索，由這些離子譜得到該多肽的氨基酸序列。依據(jù)氨基酸序列進(jìn)行的蛋白鑒定較依據(jù)多肽質(zhì)量指紋進(jìn)行的蛋白鑒定更準(zhǔn)確、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通過蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫檢索，也可通過核糖核酸數(shù)據(jù)庫檢索來進(jìn)行蛋白鑒定。
4．蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的應(yīng)用
1981年首先采用FAB雙聚焦質(zhì)譜測定肽分子量，分析十一肽(Ｍｒ=1318)，質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子[Ｍ 1] =1319強(qiáng)峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白質(zhì)合適用FAB質(zhì)譜分析，更大分子量的多肽和蛋自質(zhì)可用MALDI質(zhì)譜或ESI質(zhì)譜分析。用MALDI-TOF質(zhì)譜分析蛋自質(zhì)最早一例是Hillen Kramp等[9]于1988年提出用紫外激光以煙酸為基質(zhì)在ＴＯＦ譜儀上測出質(zhì)量數(shù)高達(dá)60kDa蛋白質(zhì)，精確度開始只有0.5%，后改進(jìn)到0.1-0.2%。質(zhì)譜技術(shù)主要用于檢測雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量，也可用于蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間相互作用等方面的研究[10,11],三條肽段的精確質(zhì)量數(shù)便可鑒定蛋白質(zhì)。近年來，串聯(lián)質(zhì)譜分析儀發(fā)展迅猛，其數(shù)據(jù)采集方面的自動化程度、檢測的敏感性及效率都大大提高，大規(guī)模數(shù)據(jù)庫和一些分析軟件(如:SEQUEST)的應(yīng)用使得串聯(lián)質(zhì)譜分析儀可以進(jìn)行更大規(guī)模的測序工作。目前，利用2D電泳及ＭＳ技術(shù)對整個(gè)酵母細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析，已經(jīng)鑒定出1484種蛋白質(zhì)，包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質(zhì)[12]；分析肝細(xì)胞癌患者血清蛋白質(zhì)組成分[13]，并利用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用質(zhì)譜技術(shù)研究許旺細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(SDNP)的分子結(jié)構(gòu)[15]等。
結(jié)束語：
在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析中，質(zhì)譜的準(zhǔn)確性(accuracy)對測定結(jié)果有很大影響，因此質(zhì)譜測序現(xiàn)在仍很難被應(yīng)用于未知蛋白的序列測定。肽和蛋白的質(zhì)譜序列測定方法具有快速、用量少、易操作等優(yōu)點(diǎn)，這些都非常適合于現(xiàn)在科學(xué)研究的需要。我們相信，隨著各種衍生化方法和酶解方法的不斷改進(jìn)，蛋白雙向電泳的應(yīng)用[16]以及質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善，質(zhì)譜將會成為多肽和蛋白質(zhì)分析最有威力的工具之一。
參考文獻(xiàn)
1． 吳世容, 李志良, 李根容, 等. 生物質(zhì)譜的研究及其應(yīng)用. 重慶大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 27(1):123-127.
2． 成海平, 錢小紅. 蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)體系及其進(jìn)展. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2000, 27:584 588.
3． 陳紹農(nóng), 潘遠(yuǎn)江, 陳耀祖. 多肽及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析新進(jìn)展. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 1995, 16(3):15-21.
4． 陳晶, 付華, 陳益. 質(zhì)譜在肽和蛋白質(zhì)序列分析中的應(yīng)用. 有機(jī)化學(xué), 2002, 22(2): 81～90.
5． 解建勛, 蒲小平, 李玉珍, 等. 蛋白質(zhì)組分析技術(shù)進(jìn)展. 生物物理學(xué)報(bào), 2001, 17:19 -26.
6． 劉慧敏, 賴志輝, 黎軍, 等. 碎片結(jié)構(gòu)分析在MALDIT OF MS法測定多肽序列中的應(yīng)用. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào), 2000, 32:179-182.
7． Lay. JOJr.MALDI-TOF mass spectrometry of bacteria. [J].MassSpectromRev, 2001; 20(4):172-194.
8． HarveyDJ. Identification of protein-bound carbohydrates by masss pectrometry [J]. Proteomic, 2001; 1(2):311-328.
9． KARASM, HILLENKAMPF. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10000 daltons [J]. Anal.Chem, 1988, 60:2299-2301.
10． 龔海霞, 陳榮華, 郭錫熔. 蛋白質(zhì)組技術(shù)及其在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用. 國外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊, 2001; 28(6):287-289.
11． 魏開華, 楊松成, 王紅霞, 等. 轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2000; 20(3,4):89-90.
12． 司英健. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容、方法及意義. 國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊, 2003; 24(3):167-168.
13． 王征, 阮幼冰, 官陽. 肝細(xì)胞癌患者血清蛋白質(zhì)組成分的雙向凝膠電泳-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析. 中華病理學(xué)雜志, 2003; 32(4):333-336.
14． 黃珍玉, 于雁靈, 方彩云, 等. 質(zhì)譜鑒定磷酸化蛋白研究進(jìn)展. 質(zhì)譜學(xué)報(bào), 2003; 24(4):494-500.
15． 鄔江, 朱家愷, 許揚(yáng)濱, 等. 許旺細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的質(zhì)譜分析. 中華顯微外科雜志, 2002; 25(4):271-273.
16． 許克新, 王云川. 雙向電泳及質(zhì)譜分析與蛋白組研究. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002; 23(22):2017-2022.
【蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析研究進(jìn)展】相關(guān)文章：
中國若干考古遺址的古食譜分析*05-04
蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)08-15
超硬材料薄膜涂層研究進(jìn)展及應(yīng)用05-03
2型糖尿病血脂異常臨床研究進(jìn)展06-01