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脂肪源干細胞上皮分化淺說在喉組織工程中的應(yīng)用
脂肪源干細胞上皮分化在喉組織工程中的應(yīng)用
聲帶瘢痕是一個較難解決的臨床問題，尚缺乏有效的治療手段，目前其主要的治療方法是向聲帶中注射填充物或細胞，試圖恢復(fù)聲帶淺層的振動性。聲帶振動受損主要是由于固有層細胞外基質(zhì)的中斷、膠原沉積增多、彈性纖維的丟失等引起。有證據(jù)表明聲帶注射細胞或基質(zhì)對恢復(fù)聲帶黏膜波的作用是有限的。另外，從人的聲帶中獲取成纖維細胞比較困難�，F(xiàn)有的組織工程方法是將聲帶的成纖維細胞包被在一系列的支架上。用自體細胞來源的組織結(jié)構(gòu)工程代替聲帶被覆黏膜可能成為嚴(yán)重聲帶瘢痕的治療方式。實現(xiàn)該目標(biāo)的第一步是構(gòu)建類似于聲帶固有層和上皮層的三維細胞群基質(zhì)。切除聲帶瘢痕后，用新的有組織結(jié)構(gòu)的細胞外基質(zhì)和上皮作為替代物，改善聲帶的振動功能。
本研究便是介紹一種新的組織工程方法來構(gòu)建聲帶被覆黏膜的替代物，以便恢復(fù)聲帶固有層和上皮的振動功能。通過脂肪抽吸分離獲得的脂肪源干細胞是一種多功能干細胞，作為一種自體間質(zhì)細胞的來源，已被廣泛用來產(chǎn)生軟骨細胞、成骨細胞和纖維細胞。脂肪源干細胞與骨髓源間質(zhì)干細胞具有相似的遺傳特征，可以分化成外胚層和內(nèi)胚層細胞。本研究假設(shè)脂肪源干細胞在氣體界面和特異性細胞因子的作用下可以分化成上皮細胞，而遠離氣體界面的細胞則可以分化為成纖維細胞。其方法是從UCLA血庫獲取冷沉淀物，一7O℃保存?zhèn)溆�。將解凍的冷沉淀物、牛凝血酶溶液以及細胞懸液�?：1：1混合形成纖維蛋白一脂肪來源的干細胞膠。在Transwell培養(yǎng)基板上形成凝膠，將一定量的細胞懸液直接加在膠上形成氣體界面。
可見在特定的生長因子和氣體界面的培養(yǎng)下，整個三維培養(yǎng)基中可見膠原產(chǎn)生，在接近上皮層的細胞中膠原沉積較多；在表皮生長因子和氣體界面培養(yǎng)下，E一鈣黏蛋白(一種上皮細胞標(biāo)志物)在三維培養(yǎng)基中陽性表達；在表皮生長因子和氣體界面下培養(yǎng)8天后，培養(yǎng)基表面的細胞中細胞角蛋白呈陽性表達；在表皮生長因子的作用下培養(yǎng)14天后，接近氣膠交界的細胞會出現(xiàn)較多的E一鈣黏蛋白表達，包埋在基質(zhì)中的細胞則無E一鈣黏蛋白的表達，而波形蛋白陽性表達較明顯。波形蛋白是一種在間質(zhì)細胞系中表達的細胞骨架蛋白，聲帶固有層中的成纖維細胞陽性表達波形蛋白。在三維培養(yǎng)基中表達波形蛋白的細胞位于表達E一鈣黏蛋白細胞的深層。
本研究構(gòu)建了聲帶黏膜的組織工程替代物，三維的纖維蛋白和脂肪源干細胞的水凝膠與聲帶的固有層和黏膜層有著相似的顯微結(jié)構(gòu)和特性。在本研究中，成人脂肪源干細胞可以雙向分化成上皮細胞和間質(zhì)細胞系，并且具有組織結(jié)構(gòu)，表皮生長因子和氣體界面是上皮分化的必備條件。本研究結(jié)果初步表明，利用組織工程制作聲帶替代物是可行的。
應(yīng)用肝細胞生長因子凝膠修復(fù)慢性聲帶瘢痕
慢性聲帶瘢痕(chronic vocal fold scar)一般繼發(fā)于喉部創(chuàng)傷、炎癥或者手術(shù)之后，由于聲帶固有層組織結(jié)構(gòu)破壞而使聲帶生物力學(xué)功能發(fā)生改變，可導(dǎo)致聲門功能障礙和嚴(yán)重的發(fā)聲困難。以往組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，聲帶瘢痕存在細胞外組織結(jié)構(gòu)的改變，如：I型膠原沉積物密集或者紊亂，彈性蛋白和核心蛋白多糖減少，纖連蛋白增加以及透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)降低等。這些組織學(xué)變化說明慢性聲帶瘢痕中成纖維細胞的表型合成異常，從而導(dǎo)致聲帶組織僵硬，因此，若使聲帶瘢痕恢復(fù)振動功能，改變纖維母細胞的表型以及修復(fù)細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)是必需的。
肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種多功能的多肽，其在胚胎形成、血管生成、器官重建和創(chuàng)傷修復(fù)方面起重要作用。HGF具有抗纖維化功能，在動物模型的研究中已證實其對肝、腎、肺的纖維組織具有預(yù)防纖維化及溶解纖維組織的作用。另有研究表明HGF具有治療聲帶瘢痕的作用，其可增加成纖維細胞中透明質(zhì)酸的產(chǎn)生并降低膠原沉積。
以往研究表明HGF對聲帶急性損傷具治療作用，但存在HGF在聲帶注射位點擴散過快、存留時間太短的缺點。本研究建立一種新型的凝膠藥物釋放系統(tǒng)(drug deliverysystem，DDs)以減緩HGF在聲帶內(nèi)的釋放、擴散，并通過犬動物模型觀察HGF—DDS對慢性聲帶瘢痕的修復(fù)作用。
實驗用水凝膠由戊二醛和酸明膠交聯(lián)化學(xué)反應(yīng)而獲得，將1 gg的HGF加入水凝膠中制備成HGF水凝膠。選用8只米格犬作為實驗對象，在直達喉鏡下將一側(cè)聲帶固有層撕剝達肌層使聲帶瘢痕化，對側(cè)聲帶作為正常對照。6個月后，將0．5 ml HGF水凝膠(含HGF 1 ug)液通過經(jīng)口聲帶注射器注入實驗組4只犬的瘢痕聲帶上皮下(HGF治療組)；另將0．5 ml PBS水凝膠液(含PBS 1 g)注入另四只狗的瘢痕側(cè)聲帶內(nèi)(對照組)，1個月后再注射1次以強化療效。
術(shù)后9個月所有犬安樂死，取喉體進行聲帶振動檢測及組織學(xué)檢查。應(yīng)用壓力傳感器檢測聲門下壓力，通過高速數(shù)字圖像系統(tǒng)記錄聲帶振動狀態(tài)，以發(fā)聲壓力閾值(pho—nation threshold pressure，PTP)評估聲帶黏膜振動，并經(jīng)公式計算振幅率(amplitude ratio，AR)及標(biāo)準(zhǔn)聲門間隙(normalizedglottal gap，NGG)。光學(xué)顯微鏡下觀察每側(cè)聲帶固有層膠原、彈性蛋白及透明質(zhì)酸，通過檢測固有層厚度判斷瘢痕收縮程度。
振動學(xué)檢查結(jié)果表明：HGF治療組聲帶黏膜振動明顯好于對照組，對照組損傷側(cè)聲帶呈弓形并且黏膜振動受限。
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