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溫度控制在蛋白質(zhì)結(jié)晶中的應(yīng)用研究
0 前言
X 射線單晶衍射技術(shù)是目前最成功的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測方法。PDB 數(shù)據(jù)庫中已有超過6萬個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而其中85%以上的結(jié)構(gòu)是通過這個方法解析得到的。雖然如此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的速度仍然遠(yuǎn)低于新功能性蛋白質(zhì)的研究需求速度。近幾年，世界范圍內(nèi)有超過1800 個基因組測序工程，其中1500 個正在進(jìn)行，335 個已經(jīng)完成測序工作[1]，已經(jīng)產(chǎn)生了超過320 萬非冗余蛋白質(zhì)序列[2]。因此，必須加快蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析速度以適應(yīng)蛋白質(zhì)序列測序工作的快速發(fā)展。
目前，生長大的衍射質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體仍舊是結(jié)構(gòu)檢測的最大障礙[3-5]。成功獲得適合衍射的蛋白質(zhì)晶體分為兩個步驟[6]：第一步是篩選結(jié)晶條件獲得晶體。當(dāng)前，稀疏矩陣法[7]
是應(yīng)用最廣泛的結(jié)晶篩選方法，該方法利用大量不同的結(jié)晶溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶來尋找合適的結(jié)晶條件。第二步是優(yōu)化結(jié)晶條件獲得衍射質(zhì)量的晶體。
蛋白質(zhì)結(jié)晶過程受多種因素影響，如沉淀劑類型、濃度、pH 值、溫度等。由于溶液的化學(xué)條件復(fù)雜，大多數(shù)研究著重在pH 值、鹽的類型、濃度和添加劑如聚合體或多羥基化合物等條件上。雖然溫度一直以來被認(rèn)為很重要[8]，但是沒有受到足夠的重視。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶實驗是在恒溫條件下進(jìn)行的，應(yīng)用最廣泛的是277K 和293K[9]。事實上很多蛋白質(zhì)只有在其適合的溫度條件下才能結(jié)出晶體[10]。
溫度對蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響，從本質(zhì)上說是由于溫度的改變引起蛋白質(zhì)的溶解度的改變，從而改變過飽和度，繼而影響蛋白質(zhì)的形核和晶體生長過程[11]。Christopher 等人[12]任意選擇30 種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其中86%的蛋白質(zhì)其溶解度受到溫度的明顯影響。通常溫度變化1K，溶解度變化約10% [13]。另外，在高沉淀劑濃度下，溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響顯著減小[14]。
控制溫度是重復(fù)結(jié)晶實驗的先決條件[15]。
溫度的研究主要集中在提高晶體質(zhì)量[16]，提高結(jié)晶篩選成功率[17,18]，溶解性[19-21]，和形核速率測量上[22]。溫度誘導(dǎo)方法既可以提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的成功率，同時也可以用來獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體。利用溫度控制蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法有很多，我們將對恒溫（篩選最佳結(jié)晶溫度）及變溫下的蛋白質(zhì)結(jié)晶研究進(jìn)行綜述。
1 恒溫應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)晶
不同蛋白質(zhì)的最佳結(jié)晶溫度不同。同一種蛋白質(zhì)不同溶液體系下，由于溶解度與溫度的關(guān)系不同[23]，最佳結(jié)晶溫度也不同。同一種蛋白質(zhì)，溫度影響溶解度的趨勢可以通過改變沉淀劑的類型來逆轉(zhuǎn)。如Histamine and V8 protease (P6306)[23]在100mM Na Acetate, 100mMNH4SCN, 20%(w/v)PEG4000， pH 5 的溶液中，其溶解度隨溫度增加而增大；而在100mMMOPS, 100mM NH4Br, 80%(w/v)PEG400，pH 7 的溶液中，其溶解度隨溫度增加而減小。大多數(shù)情況下，每種蛋白質(zhì)在特定溶液條件下，均有自己的最佳結(jié)晶溫度，因此需要考慮結(jié)晶溫度的優(yōu)化。
1.1 溶液局部區(qū)域控制溫度
蛋白質(zhì)結(jié)晶可以通過兩種方法實現(xiàn)：一種方法是異相形核，另一種方法是均勻形核。第一種方法需要有誘導(dǎo)形核的表面，而選擇合適的表面是這種方法的關(guān)鍵因素。第二種方法中需要形核的過飽和度比晶體生長所需過飽和度高很多，因此，形核的數(shù)量和晶核生長的速度都很難控制。溫度可以用來控制晶核的形成數(shù)量和晶體的生長速度[24]。DeMattei 等人[25]發(fā)展了一種控制形核和生長的方法，該方法選擇接近過飽和的均勻溶液條件，在部分區(qū)域改變溫度使其到達(dá)過飽和，從而控制形核的位置和數(shù)量。通過這種方法控制溶液小區(qū)域的溫度實現(xiàn)更少晶核的形成，成功生長了高質(zhì)量的溶菌酶晶體。
1.2 尋找最佳溫度用于蛋白質(zhì)結(jié)晶
每種蛋白質(zhì)的最佳結(jié)晶溫度是不同的。在生長蛋白質(zhì)晶體過程中，需要尋找最佳結(jié)晶溫度。由于重組云杉卷葉蛾抗凍蛋白[26]的微觀不均一性導(dǎo)致這個蛋白很難結(jié)晶，Leinala 等[26]
通過在不同溫度下篩選結(jié)晶條件，結(jié)果在318K 下獲得了衍射質(zhì)量的晶體。研究發(fā)現(xiàn)，在最佳結(jié)晶溫度下生長蛋白質(zhì)晶體減少了蛋白質(zhì)分子本身動態(tài)構(gòu)象的微觀不均一性。GrpE 蛋白是DnaK 蛋白的輔酶，是一種促進(jìn)蛋白質(zhì)分子正確折疊的分子伴侶[10]。它是從一種最佳生長溫度為338-345K 的嗜熱菌中分離得到的，這種蛋白質(zhì)必須在313K 進(jìn)行熱處理才能生長出晶體，如果不進(jìn)行熱處理就沒有晶體出現(xiàn)。這是一個典型的溫度誘導(dǎo)方法在蛋白質(zhì)結(jié)晶中應(yīng)用的例子。
Bartling 等人[27]研究了溫度對去鐵鐵蛋白結(jié)晶的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在三種鎘濃度下，隨著溫度的增加最終導(dǎo)致了的晶體尺寸線性增加。在312.5K 下生長的去鐵鐵蛋白晶體最大。
在低的鎘濃度下，溫度的影響更顯著。隨著鎘濃度的增加，去鐵鐵蛋白的溶解性對溫度變得不敏感，這和溶菌酶一樣。在高沉淀劑濃度下，蛋白質(zhì)溶解度不依賴溫度，而在較低沉淀劑濃度下，溶解度強(qiáng)烈依賴溫度[21]。
即使晶體形成后，溫度也會引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變[28]。為了抵擋X 射線衍射源的輻射，晶體一般需要保持在低溫狀態(tài)下，低溫可以增加晶體的分辨率，但也有可能引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。Dunlop 等人[28]對此進(jìn)行了系統(tǒng)的研究：將同一種蛋白質(zhì)晶體在三個室溫和三個低溫數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，雖然低溫下可獲得高分辨率的結(jié)構(gòu)和更精確更細(xì)節(jié)的信息，但是它們系統(tǒng)地背離了室溫結(jié)構(gòu)，甚至在結(jié)構(gòu)核心部分觀察到顯著的區(qū)別。這種變化在蛋白質(zhì)表面更常見。這些區(qū)別會影響生物學(xué)的解釋，因為很多重要的生物過程發(fā)生在蛋白質(zhì)表面。
因此，雖然在蛋白質(zhì)結(jié)晶中可以獲得高質(zhì)量的低溫數(shù)據(jù)，但是，室溫數(shù)據(jù)仍是需要的，特別是當(dāng)研究的蛋白質(zhì)特性對溫度的改變很敏感時。
1.3 最佳溫度篩選裝置用于蛋白質(zhì)結(jié)晶
溫度的細(xì)微改變可以顯著影響蛋白質(zhì)的溶解度。例如，溫度變化0.5K 時，溶菌酶的溶解性就會變化很大，由于這個原因，一些蛋白質(zhì)的結(jié)晶溫度需要精確控制。Landsberg 等人發(fā)明了一種最佳溫度篩選系統(tǒng)（Thermo-screen）[29]，該系統(tǒng)在一塊192 孔坐滴板上設(shè)置溫度梯度，溫度范圍277-372K，最大溫度梯度20K，間隔精度0.3K。系統(tǒng)可以同時檢測12個恒溫點下，16 個不同的結(jié)晶條件。
應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行了蛋白質(zhì)結(jié)晶實驗。實驗結(jié)果顯示溫度顯著影響溶菌酶晶體的數(shù)量和尺寸。在低溫（~279K），每孔有數(shù)百個小晶體。從恒溫279K 增加到恒溫292K，292K 下產(chǎn)生的晶體更少，晶體尺寸更大，質(zhì)量更好。這和增加溫度而致溶菌酶溶解度增加的結(jié)果一致。
在優(yōu)化溫度293K 和294.5K 之間，觀察到每個孔有一些大的六角形晶體。再增加溫度到303K導(dǎo)致晶體尺寸的減小，這可能是由于溶解度增加過大或蛋白質(zhì)已經(jīng)變性。
人類腎上腺素合成酶苯乙醇胺N -甲基蛋白(PNMT)的結(jié)晶實驗結(jié)果相反。在較低溫度（~279K）下，觀察到較少的晶體。隨著溫度的增加晶體數(shù)量減少，這和溫度與溶解度的關(guān)系相一致。在282.5-285.2K 之間，晶體數(shù)量更少，晶體尺寸更大（大至0.15mm）。然而，隨著溫度的再次增加，晶體尺寸減小，數(shù)量增加，直至293K，只能觀察到大量的小晶體。
這些結(jié)果顯示，優(yōu)化溫度在283K 左右，PNMT 晶體形貌最好。而這個溫度和大家先前用于PNMT 結(jié)晶的溫度（293K）不同。運用該系統(tǒng)得到過氧化氫酶的優(yōu)化溫度為~293 K。
1.4 篩選最佳溫度方法用于蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選
Lin 等人[18,30]研究了不同溫度下蛋白質(zhì)的相圖，比較了它們的形核區(qū)，發(fā)現(xiàn)溫度改變了形核區(qū)的大小，增加了蛋白質(zhì)的可結(jié)晶性。例如，當(dāng)溫度從295K 變?yōu)?77K 時，RibonucleaseS 和 Trypsin 的形核區(qū)面積分別增加2.4 和1.6 倍，同時結(jié)晶成功率分別從20.8%增加到42.9%，從12.5%增加到25%。Chymotrypsinogen A 和 Concanavalin A 的形核區(qū)增加到1.6和1.7 倍（溫度從277K 變?yōu)?95K），結(jié)晶成功率分別從37.5%增加到54.2%，從43.3%增加到73.4%。因此，篩選最佳溫度進(jìn)行結(jié)晶，可以顯著提高蛋白質(zhì)的結(jié)晶成功率。一種新的Epididymal-specific Lipocalin 蛋白質(zhì)，通過篩選最佳溫度，很快獲得了第一個晶體，且晶體分辨率達(dá)1.97?。因此，用不同的溫度，可以篩選到一些新的結(jié)晶條件。
2 變溫應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的研究
變溫方法主要用于生長高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體，同時也應(yīng)用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的成功率。在提高蛋白質(zhì)晶體質(zhì)量方面，通過改變溫度控制溶解度的改變，從而優(yōu)化晶體生長速度，生長高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體。在蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選時，通常事先無法確定最佳結(jié)晶溫度，通過溫度掃描方法可以覆蓋更多可能結(jié)晶的溫度點，從而獲得更多的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件。
2.1 變溫提高蛋白質(zhì)晶體質(zhì)量
2.1.1 溫度掃描生長高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體
溫度對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著的影響。有些蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度增加而增大，如溶菌酶；而有些蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度增加而減小，如糜蛋白酶原A[31]。溶解度作為溫度的函數(shù)可用Van't Hoff 公式進(jìn)行表示[32]：
式中：ΔHxtal 是形成蛋白質(zhì)晶體時的焓變，kJ/mol；B 是熵變的參數(shù)；R 是摩爾氣體常數(shù)；C*是蛋白的溶解度，mg/ml；T 是相平衡時的絕對溫度。由上式可知，當(dāng)ΔHxtal 為正值時，蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度增加而增大；當(dāng)ΔHxtal 為負(fù)值時，蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度增加而減小。一般認(rèn)為，結(jié)晶時較大的焓值對應(yīng)著晶體較大的表面能[33]。我們從一些文章中總結(jié)比較了ΔHxtal 的值，發(fā)現(xiàn)溶菌酶的ΔHxtal 是負(fù)值，這意味著溶菌酶結(jié)晶過程是放熱過程，因此溶菌酶的溶解度隨溫度增加而增大。而糜蛋白酶原A 的ΔHxtal 是正值，意味著糜蛋白酶原A 結(jié)晶過程是一個吸熱過程，因此糜蛋白酶原A 的溶解度隨溫度增加而減小。
Lu 等人[31]比較了溶菌酶在恒溫（277K，305K）和逐漸增加溫度程序（277K-305K，3K/天）對蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響，糜蛋白酶原A 在恒溫（277K，305K）和逐漸減少溫度程序（305K-277K，3K/天）對蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響。研究發(fā)現(xiàn)溫度掃描（掃溫）對溶菌酶的晶型影響很大，而對糜蛋白酶原A 的晶型影響很小。溶菌酶晶體在恒溫305K 時，形貌為拉長狀；在恒溫277K 時，形貌變的更短、更厚。在掃溫實驗中，兩種形貌都有。另外，恒溫277K時與其他程序相比，晶體形貌缺陷更多（裂紋，應(yīng)力碎片和深的裂口）。這是由于低溫時，高的過飽和度驅(qū)動晶體生長速度過高而導(dǎo)致晶體缺陷和雜質(zhì)的合并。溫度掃描保持一個穩(wěn)定的晶體生長速度，生長出了更高質(zhì)量的晶體[31]。
Budayova 等人設(shè)計了一個變溫裝置[34]，利用相圖的知識，加入籽晶后，控制溫度保持晶體在結(jié)晶溶液的亞穩(wěn)區(qū)，以較低的晶體生長速度緩慢生長高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體。了解相圖中蛋白質(zhì)溶解度和溫度的關(guān)系有利于控制溫度生長高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體。所示為溫度隨蛋白質(zhì)濃度變化的相圖示意圖。在亞穩(wěn)區(qū)形核不再產(chǎn)生，籽晶以較緩慢的速度生長。該方法利用亞穩(wěn)區(qū)的特點緩慢改變溫度，保持晶體在亞穩(wěn)區(qū)緩慢生長。此變溫裝置生長了高質(zhì)量的human γ-crystallin E, PA-IIL lectin, yeast inorganic pyropHospHatase, urate oxidase 和 humancarbonic anhydrase II 晶體。
2.1.2 優(yōu)化冷卻速度方法生長高質(zhì)量晶體
溶液過飽和度的控制對生長高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體很重要。實驗中可以通過溫度來控制溶液的過飽和度，冷卻方法是生長大的高質(zhì)量晶體的重要策略。然而，很少有人研究冷卻速度對結(jié)晶過程的影響，主要是因為沒有便利的工具優(yōu)化蛋白質(zhì)結(jié)晶的冷卻速度。為了尋找理想的條件，研究者必須準(zhǔn)備一些不同的溫度控制工具，利用不同的冷卻速度進(jìn)行結(jié)晶實驗的對比。
Adachi 等人[35]發(fā)明了一種新的溫度控制工具——即時控制溫度（TAON）法，它可以在一個結(jié)晶板上通過產(chǎn)生溫度梯度來設(shè)定多個溫度點。后來他們對此裝置又進(jìn)行了改進(jìn)，在TAON上增加電腦控制多個冷卻速度[36]。改進(jìn)的TAON 能夠同時在一塊結(jié)晶板上控制多個冷卻速度來生長蛋白質(zhì)晶體，從而更有效優(yōu)化了蛋白質(zhì)晶體生長。
該實驗首先將溶菌酶結(jié)晶溶液在恒溫293K 讓其自然形核，沒有晶體出現(xiàn)。然后改變結(jié)晶溶液溫度，冷卻速度為1.5–4.0K/天，自動設(shè)定最終結(jié)晶溫度為283K。同時用控溫箱快速冷卻樣品從293K 到283K 作為對照。比較HEWL 的結(jié)晶結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在較慢的冷卻速度下，晶體數(shù)量明顯減少。這主要是由于較慢的冷卻條件下，形核發(fā)生在較高溫度（較低過飽和度）。
相較而言，在快速冷卻條件下，晶體在較低溫度（高過飽和度）下形核，晶體數(shù)量更多。這些結(jié)果顯示在較慢的冷卻速度下，蛋白質(zhì)結(jié)晶過程變慢，生長了高質(zhì)量的溶菌酶晶體。
2.1.3 變溫保持恒定過飽和度方法生長高質(zhì)量晶體
如果想優(yōu)化生長大的適合X 射線衍射的蛋白質(zhì)晶體，有必要在結(jié)晶過程中控制恒定過飽和度水平從而保持晶體的生長速率不變，這種方法叫做恒量過飽和度方法[37]（CSC：
constant supersaturation control）。該方法可通過控制溫度而使蛋白質(zhì)溶液在亞穩(wěn)區(qū)保持恒定的過飽和度來優(yōu)化晶體的繼續(xù)生長但不再形成核子。
Schall 等人在CSC 運算中，用文獻(xiàn)[38]中測得的ΔHxtal 及生長速度參數(shù)（k，n），文獻(xiàn)[39-41]
中溶解度數(shù)據(jù)（C*），計算出溫度的變化。CSC 程序中溫度變化范圍為293K 到277K。該程序可以從一個較低的過飽和度開始，控制晶體生長速度為一個恒值。應(yīng)用CSC 程序控制，在NaCl 溶液中溶菌酶晶體的生長速度恒為7?/s。在較低的蛋白質(zhì)過飽和度下，生長速度為1-3 ? /s。Schall 等人用該方法生長了高質(zhì)量的四角形溶菌酶晶體。
這項技術(shù)需要蛋白質(zhì)的溶解度對溫度很敏感，然而并非所有的蛋白質(zhì)都如此。這時，可以通過改變結(jié)晶溶液的成分來增加溫度對蛋白質(zhì)的敏感性。選擇電解液類型和濃度是增加蛋白質(zhì)溶解度對溫度敏感的關(guān)鍵因素。一般來說，蛋白質(zhì)的溶解性在低鹽濃度下對溫度的變化更敏感。一種簡單的測量蛋白質(zhì)是否對溫度敏感的方法是通過直接測量結(jié)晶的焓變（ΔHxtal）[42]。ΔHxtal 值大則意味著溶解度對溫度敏感。增加溫度敏感性的優(yōu)勢是通過溫度的微小改變使過飽和度從相圖中的形核區(qū)迅速移向亞穩(wěn)區(qū)。在NaCl 溶液中，當(dāng)NaCl 濃度從1.25M 減少到0.75M 時，溶菌酶的ΔHxtal 增加3.8 kcal/mol（從10.7±0.9 到14.5±1.7 kcal/mol）。在NaNO3 溶液中，當(dāng)NaNO3 濃度從0.4M 變化到0.2M 時，ΔHxtal 增加了5.7 kcal/mol （從9.7±0.6到15.4±1.4 kcal/mol）。在NaSCN 溶液中，當(dāng)NaSCN 濃度從0.12M 減小到0.1M 時，ΔHxtal增加了0.9 kcal/mol（17.5±0.8–18.4±1.0 kcal/mol）。這說明可以改變結(jié)晶溶液的成分來增加溫度對蛋白質(zhì)的敏感性，從而通過調(diào)節(jié)溫度改變蛋白質(zhì)溶解度。此外，在NaCl 中加入NaSCN和NaNO3 低離子強(qiáng)度的鹽，增加了蛋白質(zhì)結(jié)晶對溫度的敏感性。
將NaCl 替換為NaNO3 和NaSCN，這些鹽溶液條件在恒溫下生長的晶體衍射質(zhì)量差，當(dāng)調(diào)用CSC 溫度程序控制后晶體更大，X 射線衍射數(shù)據(jù)顯示幾乎沒有缺陷[42]，分辨率為1.62?。此外，在CSC 溫度程序下生長的晶體抗輻射損傷能力增強(qiáng)，在連續(xù)曝光下，可衍射長達(dá)45 個小時。但是，這種方法的局限性是需要大多數(shù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)數(shù)據(jù)。
2.2 變溫提高結(jié)晶篩選成功率
與恒溫相比，在一個合理范圍內(nèi)變化溫度可以增加結(jié)晶篩選的成功率。Zhang 等人[17]
采用溫度循環(huán)策略（CTS: Cycling Temperature Strategy）研究了蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選成功率。變溫程序如（a）所示[17]。首先溫度用t1 時間從T1 線性增加到T2，然后用t2-t1 時間從T2線性減小到T1。在這項研究中，溫度增加和降低的速度相等，t2=2t1。其中T1=277K，T2=303K，t2=48h。對照實驗中恒溫為277 K。
�。╞）[17]顯示了多種蛋白質(zhì)在CTS 程序下結(jié)晶條件篩選成功率得到提高的結(jié)果。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)適合的結(jié)晶溫度未知時，CTS 程序可用于提高結(jié)晶篩選的成功率。
3 結(jié)束語
生長高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的瓶頸問題之一。在眾多影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的因素中，溫度控制是至關(guān)重要的，但一直以來沒有受到廣泛重視。本文總結(jié)了恒溫（最佳結(jié)晶溫度）和變溫對蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響。由于蛋白質(zhì)的特異性，每種蛋白質(zhì)的最佳結(jié)晶溫度有很大差異，有必要對溫度進(jìn)行篩選，這既有利于尋找到結(jié)晶條件，也有利于生長高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體。而變溫既可以用于生長高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的結(jié)晶溫度未知時，在蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選過程中，變溫也可以用來尋找結(jié)晶條件。因此，通過適當(dāng)?shù)臏囟瓤刂疲梢燥@著提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選成功率及蛋白質(zhì)晶體質(zhì)量。可見，在蛋白質(zhì)結(jié)晶過程中，對溫度的控制是不容忽視的。
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