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探討體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞分泌的松果體素在持續(xù)黑暗的環(huán)境下
1 引言
以前的研究表明，松果體素（melatonin）主要由松果體細(xì)胞分泌，它在光照/黑暗（light-dark, L－D）周期下對(duì)晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)起著很重要的作用[1, 2]。一般而言，從色氨酸合成松果體素需要一系列的酶促反應(yīng)。首先，色氨酸從血液循環(huán)中被攝取，經(jīng)過羥化，脫羧，N-乙�；脱跫谆罱K形成松果體素。其具體過程如下：色氨酸在色氨酸羥化酶（Tryptophan Hydroxylase, TPH）的作用下羥化為5-羥色氨酸(5-Hydroxytryptophan)。5-羥色氨酸經(jīng)過芳香氨基酸脫羧酶（Aromatic Amino Acid Decarboxylase）的作用轉(zhuǎn)化為5-羥色胺。5-羥色胺（5-HT）在N-乙�；D(zhuǎn)移酶（serotonin N-acetyltransferase, NAT）的作用下經(jīng)過N-乙酰化形成N-乙�；�-5-羥色胺（NAS）。最后通過氧甲基化將N-乙�；�-5-羥色胺（NAS）在羥基吲哚甲基化轉(zhuǎn)移酶（hydroxyindole-O-methyltransferase，HIOMT）的作用下迅速轉(zhuǎn)化為松果體素。合成以后的松果體素并不儲(chǔ)存在松果體，而是隨即被動(dòng)地進(jìn)入血液循環(huán)[3]。
光照可以抑制松果體素的分泌，而黑暗則可以促進(jìn)松果體素的分泌。光照在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物松果體素節(jié)律的過程中起著重要的作用。并且，視交叉上核（suprachiasmatic nuclei of thehypothalamus，SCN）是內(nèi)源性節(jié)律產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的主要結(jié)構(gòu)[4]。松果體素節(jié)律的產(chǎn)生需要以下幾個(gè)步驟：眼睛在光照－黑暗（L-D）條件下對(duì)光線的感知；視交叉上核（SCN）中 clock基因的誘導(dǎo)作用；交感神經(jīng)以節(jié)律形式傳來的神經(jīng)沖動(dòng)傳到松果體；夜晚去甲腎上腺素(NE)釋放的增多。去甲腎上腺素(NE) 和松果體的α-和β-腎上腺素能受體結(jié)合，β-受體的興奮活化腺苷酸環(huán)化酶導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的cAMP 迅速增加[5, 6]。cAMP 作為第二信使，可以調(diào)節(jié)松果體中N-乙�；D(zhuǎn)移酶（serotonin N-acetyltransferase, NAT）的活性，最終通過兩種方式導(dǎo)致松果體素的合成增加。第一種是通過cAMP 依賴的機(jī)制激活N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶（NAT）的活性，其中包括mRNA 和蛋白水平的增加；第二種主要是因?yàn)閏AMP 可以在一定程度上抑制N-乙�；D(zhuǎn)移酶（NAT）的失活[7]。N-乙�；D(zhuǎn)移酶（NAT）活性的這種節(jié)律被認(rèn)為是松果體素產(chǎn)生節(jié)律的主要原因。
有文獻(xiàn)報(bào)道，體外培養(yǎng)的雞的松果體細(xì)胞分泌的松果體素在持續(xù)黑暗的環(huán)境下仍然具有節(jié)律，并且這種節(jié)律在體外維持了幾天[8, 9]。雞的松果體素的這種節(jié)律產(chǎn)生系統(tǒng)和其他的哺乳動(dòng)物的并不一樣。雞松果體素合成的節(jié)律由兩個(gè)oscillators 調(diào)節(jié)，一個(gè)是松果體本身[10,11]，另一個(gè)在視交叉上核（SCN）[12]。盡管體內(nèi)存在兩個(gè)clocks，松果體中的clock 足以使體外的N-乙�；D(zhuǎn)移酶（NAT）活性產(chǎn)生節(jié)律。
不管在光照/黑暗（L－D）周期下，還是在黑暗/黑暗（D－D）環(huán)境下，體外培養(yǎng)的蜥蜴的松果體細(xì)胞都可以節(jié)律性的產(chǎn)生松果體素。并且，據(jù)報(bào)道，體外培養(yǎng)的蜥蜴的松果體細(xì)胞產(chǎn)生的松果體素表現(xiàn)出節(jié)律性波動(dòng)，結(jié)果暗示了體外培養(yǎng)的蜥蜴的松果體細(xì)胞起著circadian oscillator 的作用[13, 14]。近年來的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，火雞的松果體和視網(wǎng)膜松果體素的產(chǎn)生也表現(xiàn)出晝夜節(jié)律[15, 16]。他們報(bào)道說，在持續(xù)黑暗的環(huán)境下，火雞的松果體和視網(wǎng)膜中N-乙�；D(zhuǎn)移酶（NAT）的活性和松果體素的水平均具有晝夜節(jié)律。然而，他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，火雞的松果體和視網(wǎng)膜中羥基吲哚甲基化轉(zhuǎn)移酶（HIOMT）的活性不沒有表現(xiàn)出24 小時(shí)節(jié)律性波動(dòng)。
本論文采用在持續(xù)黑暗的環(huán)境下體外培養(yǎng)大鼠的松果體細(xì)胞，利用放射免疫分析（RIA）的方法檢測(cè)大鼠松果體細(xì)胞分泌的松果體素水平。目的是為了驗(yàn)證體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞是否具有 circadian clock 可以調(diào)節(jié)松果體素的節(jié)律性產(chǎn)生。Complex cosine function（CCF）統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，新生大鼠的松果體細(xì)胞產(chǎn)生松果體素的內(nèi)源性節(jié)律在持續(xù)黑暗的環(huán)境下可以維持大約9 天。上述結(jié)果暗示，它可以作為一個(gè)有用的體外模型來分析節(jié)律系統(tǒng)的生理基礎(chǔ)。
2 材料與方法
2.1 動(dòng)物和試劑
實(shí)驗(yàn)中所用的新生（1 天，SD）大鼠購(gòu)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。母鼠在20－23℃和12:12 光照/黑暗周期（7：00 開燈，19：00 關(guān)燈）環(huán)境中飼養(yǎng)。動(dòng)物飼養(yǎng)，關(guān)愛和應(yīng)用都遵循相關(guān)法律規(guī)則，并且盡量減輕動(dòng)物的疼痛。
細(xì)胞培養(yǎng)基 Dubucco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 和胎牛血清（fetal bovineserum, FBS) 購(gòu)于Gibco 生物公司。緩 沖 液HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 谷氨酰胺（L-glutamine）, 青霉素（penicillin）, 鏈霉素（streptomycin）, 兔抗5－羥色胺（rabbit anti-serotonin）, 膠原酶（collagenase）, 維生素C（Ascorbic acid）購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司。 Melatonin Research RIAkit 購(gòu)于 Labor Diagnostika Nord (LDN, Germany)公司。
2.2 松果體細(xì)胞培養(yǎng)
按照以前的文獻(xiàn)所描述的方法體外培養(yǎng)原代的大鼠松果體細(xì)胞[17]。首先取出生1 天的SD 幼鼠，75％乙醇消毒，無菌條件下取出松果體，放入冷D-PBS 溶液中。后用0．25％胰酶和100u/ml 膠原酶消化液37℃消化，20 分鐘后用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中止消化，輕輕吹吸細(xì)胞數(shù)次，將之打散成單細(xì)胞。然后1000 轉(zhuǎn)離心5 分鐘，棄上清。細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基（DMEM, 10%胎牛血清, 55 μg/ml 丙酮酸鈉, 2mM 谷氨酰胺（L-glutamine）, 25mMHEPES, 0.1mg/ml 維生素C, 4 mg/ml 葡萄糖, 100 units/ml 青霉素，0.1 mg/L 鏈霉素）重懸，并按3х105/ml 的密度接種于6 孔板，并于37℃，5％CO2 條件下培養(yǎng)。
2.3 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清
當(dāng)大鼠原代松果體細(xì)胞數(shù)達(dá)到106 時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測(cè)上清中的松果體素水平。為了檢測(cè)松果體素的晝夜節(jié)律，大鼠原代松果體細(xì)胞的培養(yǎng)上清在培養(yǎng)3，6，9，12，15天后分別在白天6：00，8：00，10：00，12:00,15:00 和夜晚18：00，20：00，22：00，1：
00，4：00 收集。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清時(shí)注意避光，并且，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清的時(shí)間不超過3分鐘。隨后，收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清在4℃12000rpm 離心10 分鐘。最后，盡快將細(xì)胞培養(yǎng)上清放于－80℃避光保存，以備檢測(cè)用。
2.4 松果體素放射免疫分析（RIA）
大鼠原代松果體細(xì)胞培養(yǎng)上清中的松果體素用放射免疫分析（RIA）法檢測(cè)，檢測(cè)步驟按照公司推薦的進(jìn)行。檢測(cè)試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的松果體素水平的檢測(cè)范圍為0pg/ml-1000pg/ml。松果體素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線高度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0 .999。為了減少誤差，每個(gè)樣本均檢測(cè)兩次。松果體素與N－已酰－5－羥色胺及5－羥色胺的交叉反應(yīng)分別為0.8%和<0.01%。松果體素檢測(cè)試劑盒的靈敏度是0.8 pg/ml。
2.5 統(tǒng)計(jì)分析
體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞分泌的松果體節(jié)律用complex cosine function (CCF)分析[18]。曲線的擬合使用非線形回歸（nonlinear regression）分析。當(dāng)p<0.1 時(shí)被認(rèn)為具有顯著性差別。
3 結(jié)果
在這篇文章中，我們分別收集了體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞在白天 6:00, 8:00, 10:00,12:00 15:00, 和夜晚 18:00, 20:00, 22:00, 1:00, 4:00 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)上清，并用放射免疫方法（RIA）檢測(cè)了各個(gè)時(shí)間點(diǎn)松果體細(xì)胞培養(yǎng)上清中的松果體素水平。預(yù)期值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。每一組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用下列的公式擬合：Y(x) =M+ A24*cos(x – ф24) + A12*cos (2x– ф12)。在這個(gè)公式中，x 代表時(shí)間點(diǎn)（in radians）。Y 代表在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)x 松果體素水平的預(yù)期值。M 代表平均值。A24 和ф24 分別是 24 小時(shí)期間的波幅和相位，而A12 和ф12 分別是12 小時(shí)期間的波幅和相位。
在空的加有胎牛血清的完全培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)有極少量的松果體素(數(shù)據(jù)未顯示)。CCF 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，大鼠松果體細(xì)胞分泌的松果體素在完全黑暗的環(huán)境下體外培養(yǎng)了3，6，9天后各個(gè)參數(shù)明顯符合CCF（p<0.1），具有晝夜節(jié)律。它提示了大鼠松果體細(xì)胞松果體素的分泌具有內(nèi)在節(jié)律。但是，這種內(nèi)在節(jié)律在體外培養(yǎng)12 天的時(shí)候就消失了。松果體素的波幅第3 天和第6 天的波幅較低，而在第9 天的時(shí)候達(dá)到最高。但是，體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞分泌的松果體素在第3 天，第6 天，第9 天，第12 天的24 小時(shí)平均水平依次升高，在第12 天達(dá)到最高，而到第15 天又開始降低。
4 討論
在這篇文章中，我們用體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞來檢測(cè)松果體細(xì)胞分泌的松果體素在完全黑暗（D-D）的環(huán)境下是否具有內(nèi)在節(jié)律。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞分泌的松果體素具有24 小時(shí)節(jié)律性波動(dòng)，并且，這種節(jié)律性波動(dòng)在完全黑暗（D-D）的環(huán)境下持續(xù)了9 天。這篇文章中的結(jié)果和以前的研究結(jié)果相一致[19]。不同之處在于他們的實(shí)驗(yàn)中用的是松果體組織，而我們用的是體外培養(yǎng)的松果體細(xì)胞。他們報(bào)道，雄性大鼠在持續(xù)黑暗（D-D）的環(huán)境下或大鼠致盲的狀況下其wheel-running activity 仍然存在。他們發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠的松果體在locomotor activity 比較高的情況下被摘掉時(shí)，其松果體中的松果體素水平要比在活性較低的情況下摘掉時(shí)的水平要高，并且，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示有顯著性差異。
以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也已經(jīng)表明，致盲或者持續(xù)黑暗的環(huán)境（D-D）可以導(dǎo)致山羊或者h(yuǎn)amster松果體細(xì)胞產(chǎn)生的松果體素晝夜節(jié)律的表達(dá)[20-22]。
許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)表明，雞的松果體細(xì)胞產(chǎn)生的松果體素在光照－黑暗（L－D）環(huán)境下甚至在持續(xù)黑暗的環(huán)境（D-D）仍然表現(xiàn)出晝夜節(jié)律[8]。他們用flow-through 培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)松果體進(jìn)行器官培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)松果體素的釋放具有節(jié)律性波動(dòng)，而且，雞的松果體素的這種節(jié)律性波動(dòng)在體外培養(yǎng)的條件下至少持續(xù)了5 天。在他們的實(shí)驗(yàn)中，松果體素的釋放在光照－黑暗（L－D）環(huán)境下表現(xiàn)出比較明顯的節(jié)律；然而，在持續(xù)黑暗的環(huán)境（D-D）中節(jié)律的波幅卻越來越低。
在這篇文章中，CCF 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，松果體素的波幅在第9 天的時(shí)候達(dá)到最高，而第3 天和第6 天的波幅較低。我們推測(cè)，松果體素第3 天的內(nèi)在節(jié)律或許是母鼠的遺傳特性，而第3 天的內(nèi)在節(jié)律或許是短暫的過渡性的。然而，松果體素真正的內(nèi)在特性在第9天形成，但是，這種內(nèi)在特性在體外培養(yǎng)12 天后就消失了。體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞分泌的松果體素在持續(xù)黑暗的環(huán)境（D-D）中表現(xiàn)出的節(jié)律性波動(dòng)明顯支持了以下觀點(diǎn)，那就是，大鼠的松果體細(xì)胞可以作為circadian oscillator 發(fā)揮作用。松果體素的這種內(nèi)在節(jié)律在體外持續(xù)一段較長(zhǎng)時(shí)間的重要性有待進(jìn)一步研究。
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參考文獻(xiàn)
[1]. Reiter R.J. (1991), Melatonin: the chemical expression of darkness.Mol Cell Endocrinol, 79 (1-3): C153-8.
[2]. Reiter R.J. (1993), The melatonin rhythm: both a clock and a calendar.Experientia, 49 (8): 654-64.
[3]. Wu Y.H., Feenstra M.G., Zhou J.N., et al. (2003), Molecular changes underlying reduced pineal melatoninlevels in Alzheimer disease: alterations in preclinical and clinical stages.J Clin Endocrinol Metab, 88 (12):5898-906.
[4]. Rusak B. and Zucker I. (1979), Neural regulation of circadian rhythms.Physiol Rev, 59 (3): 449-526.
[5]. Arendt J., Bojkowski C., Franey C., et al. (1985), Immunoassay of 6-hydroxymelatonin sulfate in humanplasma and urine: abolition of the urinary 24-hour rhythm with atenolol.J Clin Endocrinol Metab, 60 (6): 1166-73.
[6]. Steinlechner S., King T.S., Champney T.H., et al. (1985), Pharmacological studies on the regulation ofN-acetyltransferase activity and melatonin content of the pineal gland of the Syrian hamster.J Pineal Res, 2 (2):109-19.
[7]. Klein D.C., Buda M.J., Kapoor C.L., et al. (1978), Pineal serotonin N-acetyltransferase activity: abruptdecrease in adenosine 3',5'-monophosphate may be signal for "turnoff".Science, 199 (4326): 309-11.
[8]. Takahashi J.S., Hamm H., and Menaker M. (1980), Circadian rhythms of melatonin release from individualsuperfused chicken pineal glands in vitro.Proc Natl Acad Sci U S A, 77 (4): 2319-22.
[9]. Nakahara K., Murakami N., Nasu T., et al. (1997), Individual pineal cells in chick possess photoreceptive,circadian clock and melatonin-synthesizing capacities in vitro.Brain Res, 774 (1-2): 242-5.
[10]. Deguchi T. (1979), A circadian oscillator in cultured cells of chicken pineal gland.Nature, 282 (5734): 94-6.
[11]. Kasal C.A., Menaker M., and Perez-Polo J.R. (1979), Circadian clock in culture: N-acetyltransferase activityof chick pineal glands oscillates in vitro.Science, 203 (4381): 656-8.
[12]. Cassone V.M., Forsyth A.M., and Woodlee G.L. (1990), Hypothalamic regulation of circadian noradrenergicinput to the chick pineal gland.J Comp Physiol [A], 167 (2): 187-92.
[13]. Pickard G.E. and Tang W.X. (1993), Individual pineal cells exhibit a circadian rhythm in melatoninsecretion.Brain Res, 627 (1): 141-6.
[14]. Pickard G.E. and Tang W.X. (1994), Pineal photoreceptors rhythmically secrete melatonin.Neurosci Lett,171 (1-2): 109-12.
[15]. Zawilska J.B., Lorenc A., Berezinska M., et al. (2006), Diurnal and circadian rhythms in melatonin synthesisin the turkey pineal gland and retina.General and Comparative Endocrinology, 145 (2): 162-168.
[16]. Zawilska J.B., Lorenc A., Berezinska M., et al. (2006), Daily oscillation in melatonin synthesis in the turkeypineal gland and retina: Diurnal and circadian rhythms.Chronobiology International, 23 (1-2): 341-350.
[17]. Kroeber S., Schomerus C., and Korf H.W. (1998), A specific and sensitive double-immunofluorescencemethod for the demonstration of S-antigen and serotonin in trout and rat pinealocytes by means of primaryantibodies from the same donor species.Histochem Cell Biol, 109 (4): 309-17.
[18]. RUF T. (1996), The baseline cosinus function:a periodic regression model for biological rhythms.BiologicalRhyth Res, 27 153-165.
[19]. Ralph C.L., Mull D., Lynch H.J., et al. (1971), A melatonin rhythm persists in rat pineals indarkness.Endocrinology, 89 (6): 1361-6.
[20]. Rollag M.D. and Niswender G.D. (1976), Radioimmunoassay of serum concentrations of melatonin in sheepexposed to different lighting regimens.Endocrinology, 98 (2): 482-9.
[21]. Tamarkin L., Reppert S.M., Klein D.C., et al. (1980), Studies on the daily pattern of pineal melatonin in theSyrian hamster.Endocrinology, 107 (5): 1525-9.
[22]. Yellon S.M., Tamarkin L., Pratt B.L., et al. (1982), Pineal melatonin in the Djungarian hamster:photoperiodic regulation of a circadian rhythm.Endocrinology, 111 (2): 488-92.
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