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親和超濾技術(shù)的研究進(jìn)展
引言
傳統(tǒng)的分離和純化生物產(chǎn)物的方法很多，大都是利用其物理和化學(xué)性質(zhì)的差異，如分子的大小、形狀、溶解度、帶電性質(zhì)、等電點(diǎn)、親疏水性以及與其它分子的親和性等。而80年代誕生的親和超濾技術(shù)結(jié)合了親和層析與超濾技術(shù)共同特點(diǎn)，它既有良好的選擇性又易于大規(guī)模的操作，從而成為很有前途的分離純化技術(shù)。
1 親和超濾技術(shù)的基本原理及其操作體系
親和超濾[1]（Affility Ultrafiltration）是將連有特異性配基的載體（微�；蛩苄愿呔畚铮┰谶m當(dāng)流動(dòng)狀態(tài)下與目標(biāo)初提液混合，親和上偶聯(lián)的親和配基特異性地與溶液中的目標(biāo)物配合，形成體積及相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于雜質(zhì)的復(fù)合物。超濾時(shí)，復(fù)合物被超濾膜截留，而雜質(zhì)則透過(guò)膜被除去，然后用合適的洗脫劑將結(jié)合的目標(biāo)物洗脫下來(lái)，該目標(biāo)物透過(guò)膜而得到分離純化的產(chǎn)品，親和載體則被截留循環(huán)使用。一般而言，親和超濾技術(shù)的體系關(guān)鍵是選擇合適的載體、特異性配體以及合適孔徑的超濾膜。
1。1 載體
親和超濾所用的載體有兩類，一類是水不溶性微載體，另一類是水溶性大分子載體。在親和超濾中，最吸引人的是可采用水溶性高分子為載體，這種聚合物可帶有對(duì)酶、蛋白質(zhì)等起抑制作用或親和作用的官能團(tuán)，這樣親和作用在均相中進(jìn)行。水溶性高分子載體有許多優(yōu)點(diǎn)：親和載體與目標(biāo)蛋白在均相體系中反應(yīng)速度快，達(dá)到吸附或洗脫平衡的時(shí)間極短，吸附容量大。這一點(diǎn)對(duì)親和超濾很有利，可以將目標(biāo)蛋白溶液與親和載體溶液，一邊混合，一邊進(jìn)行超濾，而無(wú)需另備儲(chǔ)槽進(jìn)行反應(yīng)；洗脫時(shí)也一樣。 同時(shí)親和超濾技術(shù)也可選用小粒子載體，使其自由地懸浮在提取液中，從而增加了親和作用幾率，也防止了膜的濃差極化和堵塞現(xiàn)象。
1。2 配體（配基）
配基是親和過(guò)程的核心物質(zhì)，在分離中起特異性吸附欲分離物的作用。配基一般分為天然配基（包括糖結(jié)合配基和蛋白質(zhì)結(jié)合配基）、染料配基、氨基酸類親和配基、核苷酸及核苷酸類似物配基和仿生配基等幾類。配基與欲分離物吸附作用的大小主要與配基的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，它們與載體的連接方法也關(guān)系到洗脫過(guò)程。但它們之間的結(jié)合力仍不外乎對(duì)應(yīng)的功能基團(tuán)之間的氫鍵、靜電作用、疏水作用等。
在親和超濾過(guò)程中，大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)要求吸附（親和） 和解吸迅速。 因此，配基與欲分離目標(biāo)產(chǎn)物之間的親和力要控制在一定的范圍之內(nèi)，若親和力太低，則分離的效果不好；若親和力太高，則洗脫太困難。同時(shí)為了提高吸附量，配體必須有足夠的接觸面積（粒子盡可能小或呈多孔結(jié)構(gòu)） 并且應(yīng)廉價(jià)、專一性強(qiáng)，在親和洗脫條件下很穩(wěn)定，在高剪切力下無(wú)損傷，易回收、無(wú)毒。 若配體為小分子物質(zhì)，則必須固定于載體表面。
1。3 超濾膜
超濾膜一般為高分子分離膜，是一種具有超級(jí)“篩分”分離功能的多孔膜。它的孔徑只有幾納米到幾十納米。在膜的一側(cè)施以適當(dāng)壓力，就能篩出大于孔徑的溶質(zhì)分子，以分離分子量大于500 道爾頓、粒徑大于2～20 納米的顆粒。超濾膜根據(jù)膜材料的不同，可分為無(wú)機(jī)膜和有機(jī)膜，而膜的結(jié)構(gòu)則有對(duì)稱和非對(duì)稱之分。
親和超濾過(guò)程的透過(guò)速率由超濾膜的孔徑或截留分子量決定。選用截留分子量大的超濾膜可提高透過(guò)速率。由于超濾膜分離的選擇性較低，選用載體的分子量應(yīng)至少比親和體的分子量大10 倍[2]。此外，超濾膜在使用過(guò)程中會(huì)受到吸附、沉淀和生物等污染，使得超濾膜化學(xué)清洗頻率較高，而且超濾膜的制造成本相對(duì)較高，膜壽命較低。上述問(wèn)題，使得超濾膜工藝的運(yùn)行能耗和運(yùn)行成本中折舊費(fèi)用增加，因此人們一直在不斷開(kāi)發(fā)研究各種新型超濾膜[3—6]，以期滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。
2 親和超濾技術(shù)和傳統(tǒng)的親和層析及過(guò)濾技術(shù)的比較
親和超濾技術(shù)是親和層析技術(shù)和超濾技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，與這兩者相比，親和超濾技術(shù)在物質(zhì)分離純化方面擁有自己獨(dú)特的特點(diǎn)。
2。1 親和超濾技術(shù)和傳統(tǒng)的親和層析技術(shù)的比較
親和層析[7]（Affinity Chromatography）是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的方法。它具有很高的選擇和分離性能以及較大的載量，只需要一步處理即可使待分離的生物大分子從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái)，達(dá)到千倍以上的純化，并保持較高的活性[8]，是分離純化以及分析生物大分子尤其是蛋白質(zhì)的有力工具。
與傳統(tǒng)的親和層析技術(shù)相比，親和超濾在全混攪拌池中進(jìn)行，全部起始物料同時(shí)參與親和載體結(jié)合，對(duì)可溶性載體或超細(xì)顆粒載體，反應(yīng)能在瞬間達(dá)到平衡。由于可溶性載體配基與目標(biāo)蛋白結(jié)合的空間位阻小，配基能較為有效地發(fā)揮作用，因而吸附容量大，能在短時(shí)間內(nèi)處理大體積物料。當(dāng)物料比較稀，體積比較大時(shí)，采用親和超濾比親和層析更為合適。當(dāng)被純化產(chǎn)物濃度高，體積小時(shí)，采用親和層析更為合適。
但親和層析常有如下問(wèn)題[9] ：（1）層析柱易于阻塞和污染，使用壽命短；（2） 受基質(zhì)限制， 柱效降低；（3）在層析過(guò)程中，底物被吸附和洗脫的過(guò)程緩慢，分離周期延長(zhǎng)； （4） 某些配基與底物可存在多點(diǎn)的相互作用，這可能會(huì)造成峰分裂和不可逆吸附現(xiàn)象等。
2。2 親和超濾技術(shù)和傳統(tǒng)的超濾技術(shù)的比較
傳統(tǒng)的超濾過(guò)程是以壓力為推動(dòng)力，溶質(zhì)按分子量大小不同而分離，比膜孔小的溶質(zhì)和溶劑（水）一起透過(guò)膜，而較大的溶質(zhì)則被截留。這是一個(gè)非常簡(jiǎn)單的過(guò)程，不包括相變化，不需要加入化學(xué)試劑，而且能耗小，易于大規(guī)模操作。如孫x等[10]用超濾法純化大黃多糖；夏光輝[11]將超濾技術(shù)應(yīng)用于葡萄酒加工；劉春霞[12]等用超濾技術(shù)處理飲用水。但劉春霞等也指出：超濾技術(shù)選擇性差，不能將分子量相近的生物大分子分開(kāi)。而親和超濾技術(shù)可以很好解決這一難題，親和配基（配體）能特異性的與目標(biāo)產(chǎn)物相結(jié)合，與待分離物質(zhì)分離。
3 親和超濾技術(shù)的應(yīng)用
親和超濾技術(shù)可從稀溶液中專一地提純生物大分子。過(guò)程中不需要為了分離目標(biāo)物而引入新的化學(xué)雜質(zhì)和苛刻的操作條件，親和載體與目標(biāo)產(chǎn)物具有很好的生物及化學(xué)相容性，可避免產(chǎn)品的生物活性受到損傷。親和作用在均相或微�！合囿w系中進(jìn)行，吸附與洗脫擴(kuò)散阻力小，所有親和載體同時(shí)參加吸附或洗脫過(guò)程，載體利用率和過(guò)程速率大為提高，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)化操作。目前，親和超濾技術(shù)已經(jīng)在蛋白質(zhì)分離、酶分離、手性拆分等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用。
3。1 親和超濾在蛋白質(zhì)分離方面的應(yīng)用
蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它是與生命及與各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。純蛋白在食品，醫(yī)藥，化妝品等行業(yè)有著極其重要的作用。
Mattiason 等[13]利用熱殺死酵母細(xì)胞為載體，細(xì)胞表面存在的糖為配基，從刀豆中提取伴刀豆蛋白，用分子截留值30 萬(wàn)—100 萬(wàn)的超濾膜過(guò)濾，以葡萄糖為洗脫劑，最后得到純產(chǎn)品，收率為70%以上。Power 等[14]將生物素共價(jià)結(jié)合到平均粒徑為74nm 脂質(zhì)體上，制成親和載體用于從含有溶菌酶和細(xì)胞色素C 的模擬雜質(zhì)中分離抗生素蛋白，回收率為50%。
Rao 等[15]使用藍(lán)色染料為親和配基，再生纖維素膜共價(jià)結(jié)合一個(gè)磺酸基從而形成帶負(fù)電的過(guò)濾膜，通過(guò)兩者之間的靜電相互作用來(lái)分離牛血清白蛋白和卵蛋白。結(jié)果表明牛血清白蛋白純化了90 多倍，收率大于90％。并指出，使用小的帶電親和配體可提高蛋白質(zhì)分離的潛力。
3。2 親和超濾在酶分離的應(yīng)用
通常酶也是蛋白質(zhì)，但酶又不完全等同于蛋白質(zhì)，有著自己獨(dú)特的性質(zhì)。酶的催化作用有如下特性：高效性、專一性、多樣性、溫和性。因此，酶的分離純化工藝往往更加苛刻。
Male 等[16]采用在無(wú)氧的條件下，經(jīng)N—丙烯酰—間— 氨基苯甲脒和丙烯酰胺共聚而成的聚合物作為大分子配體，采用親和超濾技術(shù)從人尿液中分離純化尿激酶。整個(gè)親和超濾過(guò)程尿激酶的收率為49 % ，所得的尿激酶的比活力接近于最高商品級(jí)。由于人尿液中還含有其它分子量很高的組分，因此需要在親和超濾分離純化尿激酶前，需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理[17]。
Teke 等[18]用親和超濾技術(shù)分離純化牛胰磷脂酶A2 （PLA2）。這種方法是基于殼聚糖—磷脂酰乙醇胺的合成樹(shù)脂為親和載體，在Ca2+存在條件下進(jìn)行親和超濾，最后以EDTA 為洗脫劑，結(jié)果顯示該酶被純化79 倍，活性回收率為76。3％。
Luong 等[19]采用與Male 實(shí)驗(yàn)用的相同大分子為配體，與提取液中的胰蛋白酶相互作用形成復(fù)合物，然后使用連續(xù)親和超濾技術(shù)，使胰蛋白酶—大分子配體復(fù)合物被截留而其它雜質(zhì)則通過(guò)膜，用精氨酸或氨基苯甲脒對(duì)復(fù)合物進(jìn)行洗提，從復(fù)合物中分離出胰蛋白酶。連續(xù)親和超濾技術(shù)從豬胰腺中分離純化胰蛋白酶的產(chǎn)率高，所得產(chǎn)品純度高。而Powers 等則采用改性脂質(zhì)體作為大分子配體，以親和超濾技術(shù)來(lái)分離和純化胰蛋白酶。
Mukherjee 等[20]考察了聚醚膜和聚乙烯膜兩種不同的膜來(lái)分離純化胰蛋白酶的能力，比較了兩種膜（截留分子量均為30 kDa）的相對(duì)性能。研究表明：兩種膜在提取胰蛋白酶活性相近（聚醚膜為74％，聚乙烯膜為70％）的前提下，使用聚醚膜的總蛋白回收率（70％）是聚乙烯膜（46％）的的1。5 倍。在親和超濾的洗滌和洗脫階段，聚醚膜均比聚乙烯膜有利于持續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。
Vedajnananda[21]等進(jìn)行了半連續(xù)—親和超濾分離純化胰蛋白酶的數(shù)學(xué)模擬。實(shí)驗(yàn)使用再生纖維素膜（截留分子量：30 kDa）為超濾膜，大豆胰蛋白酶抑制劑為親和配體，從胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物中分離純化胰蛋白酶。實(shí)驗(yàn)中二者的濃度為0。02 毫克/毫升，濃度比例一直維持在50：1，超濾的壓力在199。4—395。5 千帕范圍。結(jié)果：在160 秒內(nèi)，胰蛋白酶的濃度從超濾模擬系統(tǒng)中它的初始值下降至零，而胰凝乳蛋白酶的濃度下降到零則用了300 秒。從而證明了使用半連續(xù)—親和超濾分離純化胰蛋白酶的可行性。
3。3 親和超濾在手性拆分方面的應(yīng)用
許多有機(jī)化合物分子都有“對(duì)映異構(gòu)體”，即具有“手性”。如α—氨基酸，在碳連接有一個(gè)羧基、一個(gè)氨基、一個(gè)烴基和一個(gè)氫原子（或一個(gè)不同于前邊的烴基）。由于對(duì)映體之間理化性質(zhì)的相近，分離和合成出純凈的對(duì)映體一直是人類夢(mèng)昧以求的事業(yè)。目前親和超濾技術(shù)分離手性化合物的研究中以氨基酸的研究居多。
Poncet 等和Garnier 等[22]都采用牛血清蛋白作為大分子配體來(lái)拆分色氨酸消旋體，當(dāng)溶液的pH 值為9 時(shí)，采用單級(jí)親和超濾技術(shù)分離出的D — 色氨酸的純度為91 % ， 整個(gè)過(guò)程拆分回收率為89 %。而Romero 等[23 ]采用相同的大分子配體來(lái)拆分色氨酸消旋體，采用二級(jí)親和超濾技術(shù)，則可使分離出的L — 色氨酸的純度大于90 % ，整個(gè)過(guò)程的回收率為60 %，并指出采用二級(jí)親和超濾技術(shù)可以有效的避免截留滯留物（復(fù)合物） 的累計(jì)，因此可獲得更高的提純倍數(shù)。
Overdevest 等[24]采用具有對(duì)映選擇性的膠束作為大分子配體，通過(guò)親和超濾技術(shù)來(lái)拆分苯丙氨酸消旋體。在該過(guò)程中，具有對(duì)映選擇性的膠束優(yōu)先與一種對(duì)映異構(gòu)體結(jié)合而形成復(fù)合物，而未結(jié)合的對(duì)映異構(gòu)體則通過(guò)超濾膜。
傾斜超濾技術(shù)可以連續(xù)不斷的去除濾餅， Iritani 等[25]使用親和傾斜超濾技術(shù)分離色氨酸對(duì)映體：以牛血清蛋白為立體選擇性配基，使用垂直放置的單通模式的中空纖維膜為超濾膜，在pH 值7 的條件下進(jìn)行分離。結(jié)果表明：右旋色氨酸優(yōu)先和牛血清白蛋白結(jié)合，過(guò)濾速度與牛血清白蛋白的濃度相關(guān)，但并未受到濃縮物流速的影響，因?yàn)槎逊e于膜上的濾餅即使在很低的流速下也可以在重力的作用下被移除。
Romero[26]采用模擬系統(tǒng)分析親和作用力受溶液的pH 值和鹽的濃度的影響。實(shí)驗(yàn)以牛血清白蛋白為親和配基來(lái)分離的D —和L —色氨酸對(duì)映體， 結(jié)果表明L —色氨酸和牛血清白蛋白的最大結(jié)合度是在pH 值為7 至10，在這個(gè)PH 范圍之類純化度顯著增加。
4 展望
親和超濾技術(shù)作為一種新興的分離純化技術(shù)，具有親和層析和膜過(guò)濾的優(yōu)點(diǎn)，不僅利用了生物分子的識(shí)別功能，而且操作簡(jiǎn)單、易于放大，是現(xiàn)代分離工程的一項(xiàng)重要技術(shù)。對(duì)親和超濾進(jìn)行的一系列研究結(jié)果表明，親和超濾技術(shù)具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。另外，雖然親和過(guò)濾在分離純化酶和蛋白質(zhì)等生物大分子方面的優(yōu)越性很多，但是其應(yīng)用領(lǐng)域仍然不夠，特別是國(guó)內(nèi)的此方面分離科學(xué)研究，目前幾乎未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，亟待引起重視和發(fā)展。此外，親和超濾技術(shù)本身還有諸多疑難點(diǎn)，如減少非特異性吸附，載體的反復(fù)利用后的污染等問(wèn)題尚待解決，相信隨著親和過(guò)濾技術(shù)的不斷完善，在不遠(yuǎn)的將來(lái)會(huì)走上工業(yè)化應(yīng)用之路。
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