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生物酶解破壁提制葛根黃酮的工藝
引言
葛根富含葛根淀粉和總黃酮（含量約為1-12%）。由于我國(guó)農(nóng)作物利用較粗放，葛產(chǎn)業(yè)基本上集中在葛根淀粉的提取[1]，淀粉中異黃酮含量?jī)H占葛根總黃酮的2.4％，95％以上尚留在葛根廢渣被丟棄，高附加值的天然活性成分浪費(fèi)嚴(yán)重。作為醫(yī)藥和保健食品的原料或添加劑[2]，目前，國(guó)際市場(chǎng)葛根黃酮每年需求量約在500－800 噸，在美國(guó)，食用酮類食品的人數(shù)超過(guò)１億３千多萬(wàn)人；而我國(guó)的每年需求量約在150 噸左右。將生物酶促法應(yīng)用到葛根黃酮的提取，主要是利用微生物充分破壞植物細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，將植物組織分解成小分子物質(zhì)，減少提取傳質(zhì)阻力，充分釋放活性成分，具有提取物穩(wěn)定、純度高、能耗低、有機(jī)溶劑使用量少等特點(diǎn)[3]；目前，湯海鷗[4]、施英英[5]等采用纖維素酶和木聚糖酶等對(duì)提取葛根黃酮進(jìn)行報(bào)道。隨著人們對(duì)葛根功能性和營(yíng)養(yǎng)性研究的深入，采用生物酶化工藝，在減少葛產(chǎn)業(yè)集約化發(fā)展引起的葛根廢渣環(huán)境污染的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)葛根廢渣的資源化利用提供一條新途徑。
1 主要儀器、試劑和測(cè)試方法
1.1 儀器與試劑
儀器：UV-2450 紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，DELTA 320-5pH 計(jì)，RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，126P/166P高效液相色譜儀，SPX-250-Z 振蕩培養(yǎng)箱原料：葛廢渣取至重慶北碚農(nóng)村（除去葛根淀粉）試劑：葛根素（標(biāo)品）；乙醇（分析純）、正丁醇（分析純）、硫酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、葡萄糖(分析純)、甲醇(分析純)
1.2 實(shí)驗(yàn)
1.2.1 菌種培育
選用黑曲霉，分別經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)、種子液體培養(yǎng)后，將培養(yǎng)好的菌種接種裝入液量為60 ml250ml 三角瓶中，接入量為5%，29℃，180rpm，混合培養(yǎng)48h。
1.2.2 微生物酶化提取葛根黃酮
取烘干、粉碎后過(guò)40 目篩的葛渣樣品3.5g，加入豆粕1.0g 至250ml 干凈的錐形瓶中，加入蒸餾水，接入一定量種子液, 設(shè)定pH 值和發(fā)酵時(shí)間，考察接種量和培養(yǎng)基質(zhì)及不同工藝參數(shù)對(duì)葛根黃酮溶出的影響
1.2.3 主要控制參數(shù)及發(fā)酵工藝流程
葛根渣與輔料之比為7:2，固液比為1:20，接種量50%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為60h，pH 值為5，豆粕的重量百分量為5%～25%；接種量為40%；pH 值為6，在30℃下連續(xù)反應(yīng)48h 反應(yīng)在生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行，間歇通過(guò)無(wú)菌空氣(平均 10min/h)
1.3 葛根黃酮的測(cè)定
采用色譜分析方法[6]測(cè)定葛根素標(biāo)品。精密稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5.2mg，經(jīng)甲醇定容并配置成1.04mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，分別移取1ml、0.5ml、250ul、100ul、50ul、25ul、5ul 標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用甲醇稀釋并定容至5ml；設(shè)定色譜條件為色譜柱C18，柱溫30℃，流動(dòng)相為：甲醇-水（25：75），檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，流速為1.0ml/min，進(jìn)樣體積為10ul；通過(guò)分析檢測(cè)得出峰面積繪制葛根黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：y=35415x-14502， R?=0.9993。
2 結(jié)果與討論
2.1 不同方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)
2.1.1 葛渣不同處理方式對(duì)葛根黃酮含量影響
葛根黃酮等植物有效成分大都被包裹在葛渣細(xì)胞壁中。微生物能產(chǎn)生木聚糖酶和內(nèi)切-β-葡聚糖酶(CMC 酶)，破壞葛渣細(xì)胞壁的纖維結(jié)構(gòu)，甚至將其分解成小分子物質(zhì)，減少提取傳質(zhì)阻力，有效釋放葛根黃酮等活性成分。通過(guò)圖2 葛渣不同處理方式的對(duì)比可知，采用黑曲霉和康寧木霉發(fā)酵36h 后所得葛根黃酮的含量均高于未發(fā)酵處理，其中黑曲霉在發(fā)酵60h 時(shí)葛根黃酮含量達(dá)到最高，為1.078ug/ml。
2.1.2 不同發(fā)酵方式對(duì)葛根黃酮含量影響
不同菌種對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求不一樣。從圖3 可知，采用黑曲霉進(jìn)行好氧發(fā)酵在每一時(shí)段其葛根黃酮濃度均大于厭氧發(fā)酵產(chǎn)量，且在60h 時(shí)能得到葛根黃酮的最大濃度為1.078ug/ml。
原因在于：黑曲霉生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生酶，加快葛渣纖維組織降解能力；在這過(guò)程中，充足的氧氣會(huì)促使微生物生長(zhǎng)，增加酶產(chǎn)生量，從而促進(jìn)葛渣纖維組織的降解，提高葛根黃酮的溶出量。
此外，通入氧氣還可減少因厭氧發(fā)酵造成的惡臭。
2.2 培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)葛根黃酮含量的影響
2.2.1 輔料碳氮源對(duì)葛根黃酮含量影響
菌種生長(zhǎng)有一周期，需要營(yíng)養(yǎng)底物；如果營(yíng)養(yǎng)不足，會(huì)導(dǎo)致菌種生長(zhǎng)所需的能量、碳氮源等成分不足影響生長(zhǎng)，減緩纖維素等植物組織分解減緩，阻礙葛根黃酮溶出；但如果營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，又會(huì)使菌種提早達(dá)到衰亡期，使葛根黃酮溶出受抑制。從圖4 可知，輔料豆粕加入量與葛根黃酮的含量關(guān)系呈曲線走勢(shì)，3.5g 葛渣，加入豆粕量為1.0g 時(shí)，葛根黃酮的含量最大為0.986 ug/ml。
2.2.2 不同接種量及對(duì)葛根黃酮含量的影響
設(shè)定黑曲霉接種量為原料的20%、30%、40%、50%、60%的比例加入原料中。由圖5可知，接種量為50%即菌液量為1.75ml 時(shí)，葛根黃酮的含量最高，為0.529 ug/ml。原因在于菌種含量對(duì)葛根黃酮溶出的影響主要表現(xiàn)在如加入的菌種太多，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)，會(huì)加劇菌種之間的競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致太多菌種提前死亡；加入的菌種太少會(huì)因營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，還未與植物組織完全發(fā)生酶促反應(yīng)前，便提前達(dá)到生長(zhǎng)旺盛期頂點(diǎn)，隨之衰亡，凋零。
2.2.3 不同發(fā)酵溫度及對(duì)葛根黃酮含量的影響
酶類屬于蛋白質(zhì)類物質(zhì)，其對(duì)溫度大都非常敏感。適宜的溫度不僅可以加快微生物的生長(zhǎng)和繁殖，還可以增大酶活性，促進(jìn)植物纖維的降解。由圖6 可以看出，發(fā)酵溫度對(duì)葛根黃酮影響很大，在溫度為30°C 時(shí)，葛根黃酮含量最高為1.4719 ug/ml。
2.2.4 不同pH 值及對(duì)葛根黃酮含量的影響
體系環(huán)境的酸堿性也會(huì)影響菌種的生長(zhǎng)。由圖7 可以看出，當(dāng)體系的pH 值為5 時(shí)，黑曲霉生長(zhǎng)最適應(yīng)，葛根黃酮其濃度能達(dá)到最大值，為346.63 ug/ml。
2.3 超聲波萃取葛根黃酮產(chǎn)品
2.3.1 最佳單因素條件的復(fù)合實(shí)驗(yàn)
通過(guò)單因素探討，確立出生物酶化法提取葛根黃酮的最佳實(shí)驗(yàn)條件；取葛渣3.5ｇ，選定各最優(yōu)單因素條件，進(jìn)行最優(yōu)單因素的復(fù)合實(shí)驗(yàn)，經(jīng)高效液相色譜法分析，譜圖如圖8（a）；測(cè)得葛根黃酮濃度為37.688ug/ml，葛根黃酮含量明顯高于任一單因素所得值；對(duì)照標(biāo)品的液相色譜圖圖8（b），其峰型與出峰世界時(shí)間相似；此外，樣品譜圖在9 分鐘前還存在其他峰，說(shuō)明采用生物酶促反應(yīng)，還可以得到葛渣其他活性成分。
2.3.2 超聲波協(xié)助生物酶化反應(yīng)提高產(chǎn)品含量
為充分提高葛根黃酮產(chǎn)率，在獲得生物酶化反應(yīng)的最佳工藝條件基礎(chǔ)上，分別選用3.5克葛渣，通過(guò)提取產(chǎn)品量，考察超聲波協(xié)同作用。其結(jié)果見(jiàn)表1。從圖9 可知，生物酶化反應(yīng)獲得葛根黃酮為1.446mg/g,而超聲波協(xié)同生物酶化反應(yīng)獲得葛根黃酮為2.974 mg/g，含量明顯高于其他兩種反應(yīng)，葛根黃酮含量結(jié)果表明超聲空化作用有助于破壞細(xì)胞膜，促進(jìn)黃酮類化合物釋放與溶出,且超聲波的不斷震蕩和熱效應(yīng),不僅有助于溶質(zhì)擴(kuò)散,同時(shí)對(duì)原料起水浴作用。
3 結(jié)論
（1）從生物多樣性出發(fā)，采用生物酶促反應(yīng)有助于葛渣中葛根黃酮溶出，并經(jīng)超聲波協(xié)同處理葛根廢渣后，葛根黃酮含量較單一處理的產(chǎn)物高。
（2）從微生物發(fā)酵過(guò)程中影響因素出發(fā)，選用黑曲霉菌種，最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：菌種接種量為50%，固液比為1：20，葛根渣與輔料之比為7：2，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間60h，pH 值為5，能得到葛根黃酮濃度為37.688ug/ml，葛根黃酮含量為每克葛渣含葛根黃酮1.446mg/g；超聲波處理能得到2.974 mg/g。
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