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抗生素微生物檢定及比濁法在效價(jià)測(cè)定中關(guān)鍵控制點(diǎn)
自1929年英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗來(lái)明發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)抗生素一青霉素至今已有半個(gè)多世紀(jì)，隨著抗生素種類不斷增加，在治療感染性疾病和保障健康方面作出了令人矚目的貢獻(xiàn)。在當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)臨床上，抗生素類藥物已是一類不可缺少的重要化學(xué)藥物，在很多國(guó)家的醫(yī)藥T業(yè)中產(chǎn)值均居于首位�？股卦谵r(nóng)牧業(yè)上也被廣泛應(yīng)用，隨著抗生素應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，對(duì)抗生素藥品的分析工作更加繁重，現(xiàn)代化學(xué)分析技術(shù)不斷發(fā)展，特別是各種儀器分析和自動(dòng)分析技術(shù)的日新月異，有可能對(duì)各種抗生素進(jìn)行有效的快速測(cè)定，但傳統(tǒng)的生物檢測(cè)法及經(jīng)典的化學(xué)分析方法還是目前各國(guó)藥典中采用最多、最主要的檢測(cè)方法。為保證抗生素藥品的安全有效性，對(duì)抗生素藥品的檢測(cè)及質(zhì)量控制顯得尤為重要。
抗生素微生物檢定法是國(guó)際上通用的經(jīng)典測(cè)定法，由于微生物檢定法的特點(diǎn)是直觀和特異地反應(yīng)抗生素藥品抗菌活性的差異，化學(xué)測(cè)定結(jié)果難于準(zhǔn)確表征組分組成、含量和活性的關(guān)系，許多抗生素品種由于各種原因， 目前沒(méi)有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)分析方法表征其活性，同時(shí)，微生物檢定法所需的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低廉，故抗生素微生物檢定法目前在各國(guó)藥典中仍占有重要地位。
1 分類
單組分抗生素由于結(jié)構(gòu)明確，含量和生物活性相一致，采用化學(xué)分析方法測(cè)定含量是其發(fā)展趨勢(shì)，但對(duì)于慶大霉素、乙酰螺旋霉素和吉他霉素等多組分抗生素來(lái)說(shuō)，各國(guó)藥典均采用微生物效價(jià)測(cè)定法。
由于抗生素對(duì)微生物具有殺菌和抑菌作用，這是其他物理學(xué)或化學(xué)方法不能達(dá)到的，因此，用抗生素對(duì)細(xì)菌的抑制程度來(lái)檢定和表示效價(jià)是有實(shí)際意義的�？股匚⑸餀z定法可分為稀釋法、比濁法和管碟法。
2 微生物比濁法測(cè)定原理及優(yōu)點(diǎn)
將不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、供試品和接有試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基加入比色池中，經(jīng)培養(yǎng)一定時(shí)間，約3～4 h，通過(guò)抗生素對(duì)細(xì)菌的抑制作用來(lái)觀察試驗(yàn)菌生長(zhǎng)混濁度，其混濁程度與細(xì)菌數(shù)的增加存在直接關(guān)系，當(dāng)一定光束照射在混濁的液體培養(yǎng)基時(shí)，測(cè)定其透光率。
采用抗生素比濁法測(cè)定抗生素，保證了濁度測(cè)定中的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和測(cè)量結(jié)果的均一性，實(shí)現(xiàn)了在線檢測(cè)，并通過(guò)試驗(yàn)材料的標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一化，控制培養(yǎng)基和緩沖液的質(zhì)量，可保證相對(duì)穩(wěn)定的水平，降低抗生素微生物檢定的測(cè)定誤差，耗時(shí)短，出結(jié)果快速，降低可信限率，借助儀器檢測(cè)可同時(shí)測(cè)量3批樣品，減少人為因素。
3 抗生素微生物檢定比濁法在效價(jià)測(cè)定中關(guān)鍵控制點(diǎn)
3．1培養(yǎng)溫度的控制比濁法對(duì)溫度的要求較管碟法更加精確，管碟法的培養(yǎng)溫度要求(37±0．5)℃ ，而比濁法為(37±0．1)℃，對(duì)溫度的要求更加嚴(yán)格，在比濁法培養(yǎng)過(guò)程中，溫度的均一性控制非常重要，保證各點(diǎn)溫度的均勻是保證細(xì)菌正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，也是試驗(yàn)成功的重要因素。
3．2儀器結(jié)構(gòu)與比色池的排列采用的儀器型號(hào)為WBS一100微生物比濁法測(cè)定儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)，其排降為拉丁方排列，可抵消培養(yǎng)過(guò)程中區(qū)域性的誤差，使分組更加明確，排除培養(yǎng)基加入時(shí)間先后的誤差。儀器中的感溫器必須正確放置，使溫度得到更好的控制。試驗(yàn)中采用振搖培養(yǎng)，不致使細(xì)菌沉降于比色池底部，增加氧氣循環(huán)，有利于細(xì)菌生長(zhǎng)。
3. 3菌液的影響因素配制：取金黃色葡萄球菌CMCC(B)(26003)的第三代營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，35～37 cI=培養(yǎng)2O～22 h后，用0．9％ 無(wú)菌氯化鈉注射液洗下菌苔備用。菌液應(yīng)當(dāng)天配制，當(dāng)天使用。如采用冰箱放置第2天使用的菌液，此時(shí)菌液中的細(xì)菌開(kāi)始老化，并部分死亡，所測(cè)出的數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，造成較大的誤差。
3．4培養(yǎng)基成分及pH的影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速度，在沒(méi)有外加抑制物存在的情況下與培養(yǎng)基的成分、pH、培養(yǎng)溫度、通氣條件及細(xì)菌內(nèi)在的繁殖能力有關(guān)。培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分應(yīng)能滿足細(xì)菌快速生長(zhǎng)的需要，培養(yǎng)基的pH也是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵。一般情況下，pH偏低會(huì)導(dǎo)致金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)緩慢，使培養(yǎng)物濁度減少，誤差增大，pH過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏離，所以，適宜培養(yǎng)基的pH滅菌后應(yīng)在7～7．2。
3．5比色池清潔度的影響測(cè)定用的比色池應(yīng)采用硫酸一硝酸(95：5)浸泡，并用蒸餾水沖洗干凈�？股乇葷岱y(cè)量質(zhì)量濃度一般為0．1～1 U／mL，而原始溶液質(zhì)量濃度為1 000 U／mL。在稀釋過(guò)程中，所有試驗(yàn)物品一定要清洗干凈，消毒滅菌，試驗(yàn)中一旦污染會(huì)導(dǎo)致被污染管濁度異�；蛟斐赏|(zhì)量濃度抗生素管結(jié)果差異明顯，可信限升高(可信限率(FL)％)，可采用清水沖洗高質(zhì)量濃度器具，采用專用洗刷池為宜，并與培養(yǎng)后的比色池或試管分開(kāi)清洗，清洗時(shí)不得用毛刷，防止劃痕。
3．6氣泡的影響因素待加人各種所需物質(zhì)后，將比色池物質(zhì)充分混勻，采用WBS一100微生物比濁法測(cè)定儀，可自動(dòng)間歇振搖，振搖時(shí)不得產(chǎn)生氣泡，有氣泡則干擾測(cè)定結(jié)果，此點(diǎn)尤為重要。
3．7微生物的污染(菌種不純)在配制菌懸液時(shí)所用器皿必須嚴(yán)格高壓滅菌，切忌使用未經(jīng)滅菌的試管及物品進(jìn)行試驗(yàn)，防止造成原始菌液的污染。另外，菌液的不純也屬于微生物污染，表明正常試驗(yàn)菌種被其他雜菌所污染，從而導(dǎo)致生物反應(yīng)紊亂，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素的反應(yīng)靈敏度降低，曲線不規(guī)則等現(xiàn)象。使精密度差，因此，在操作中要保持試驗(yàn)環(huán)境清潔，嚴(yán)防污染微生物，一旦被污染，可重新開(kāi)啟一支凍干菌種，從新傳代，致使試驗(yàn)菌達(dá)到要求。
3．8時(shí)間的一致性在加入標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液及含試驗(yàn)菌的培養(yǎng)基后，混合均勻，為防止培養(yǎng)基中的試驗(yàn)菌提前生長(zhǎng)，必要時(shí)將培養(yǎng)基放置2～4℃冷卻，適時(shí)取出加入菌液，此法可避免試驗(yàn)時(shí)加注時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和加入先后不同而造成誤差，每個(gè)比色池的培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)一致。
3．9抗生素微生物比濁法展望隨著抗生素微生物比濁法的出現(xiàn)，2012年獸藥典將收載約10個(gè)抗生素品種采用比濁法測(cè)定效價(jià)，這將大大減少耗時(shí)和提高檢測(cè)效率。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷提高，抗生素微生物檢定比濁法在菌液質(zhì)量濃度和加菌量、抗生素質(zhì)量濃度的稀釋范圍、培養(yǎng)基、緩沖液標(biāo)準(zhǔn)控制、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的制備、上機(jī)質(zhì)量濃度范圍、全程試驗(yàn)的環(huán)境條件及所用物品的滅菌要求，污物的處理等應(yīng)制定出嚴(yán)格的規(guī)范和要求，是抗生素微生物檢定比濁法的發(fā)展方向。
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