響應(yīng)面法優(yōu)化耐有機(jī)溶劑脂肪酶營(yíng)養(yǎng)條件

　　摘要：本文以響應(yīng)面法對(duì)蠟狀芽孢桿菌SWWL6 液體發(fā)酵產(chǎn)酶的營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源、氮源及無機(jī)鹽分別為可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4? 7H20 和NaCl。采用部分因子分析法研究初始發(fā)酵培養(yǎng)基各種組分對(duì)產(chǎn)酶的影響程度，發(fā)現(xiàn)酵母膏、NH4NO3 的質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響顯著。通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域。中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成為酵母膏0.64%、NH4NO3 0.384%、可溶性淀粉1%、MgSO4? 7H20 0.1%，NaCl 0.25%，甲苯20%。優(yōu)化后相對(duì)酶活比優(yōu)化前的提高了3.48 倍。
　　
　　關(guān)鍵詞：耐有機(jī)溶劑；脂肪酶；響應(yīng)面法；蠟狀芽孢桿菌
　　
　　0 引言
　　
　　脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一類重要的甘油酯鍵水解酶，可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油。在特定的非水相系統(tǒng)中，還可催化水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，以及酯化合成和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。從催化特性來看，脂肪酶具有化學(xué)選擇性、高度的立體異構(gòu)專一性、不需輔酶、高效、反應(yīng)條件溫和、無毒、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。近年來，隨著非水相酶學(xué)的不斷深入，脂肪酶的應(yīng)用已超出了水相中水解反應(yīng)的范圍，被廣泛應(yīng)用于有機(jī)相中酯的合成、手性化合物的拆分、高聚物的合成、肽合成、生物柴油的合成等方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。有機(jī)合成大多數(shù)是在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行的，而有機(jī)溶劑則易引起蛋白質(zhì)的變性，使酶失活，因此限制了酶在有機(jī)合成中的應(yīng)用[1]。如果一種脂肪酶能在高濃度的有機(jī)溶劑中具有穩(wěn)定性，就能很好的解決催化環(huán)境受限的問題，使酶的催化反應(yīng)更容易化，同時(shí)降低了酶的生產(chǎn)成本。
　　因此耐有機(jī)溶劑脂肪酶的研究具有非常重要的意義。目前，關(guān)于耐有機(jī)溶劑脂肪酶的研究多見于國(guó)外報(bào)道，日本的Ogino H 等人篩選到有機(jī)溶劑耐受菌Psudomonas aeruginosaLST-03[2]。國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道，尤其是關(guān)于蠟狀芽孢桿菌脂肪酶還沒有見到報(bào)道。
　　隨著計(jì)算方法的完善和微機(jī)應(yīng)用的普及，響應(yīng)面方法已被成功應(yīng)用于科學(xué)研究的許多領(lǐng)域[3、4]。它是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法[5]，采用更為合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，能以最經(jīng)濟(jì)的方式對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行全面研究。該方法已被廣泛地用于同時(shí)存在多因素影響的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化上。本文結(jié)合了單因素實(shí)驗(yàn)、部分因子實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面法對(duì)Bacillus cereus SWWL6 發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，從而提高脂肪酶的產(chǎn)量，為耐有機(jī)溶劑脂肪酶的進(jìn)一步分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
　　
　　1 材料與方法
　　
　　1.1 試驗(yàn)菌株蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）SWWL6 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究室保藏菌株。
　　
　　1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件斜面培養(yǎng)基：橄欖油0.1%，蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH 7.0種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，pH 7.0發(fā)酵培養(yǎng)基：橄欖油1%，酵母浸膏0.5%，MgSO4·7H20 0.1%，NaCl 0.25%,甲苯20%，pH 7.0將斜面活化后的菌種接至裝有50mL 種子培養(yǎng)基的250mL 三角瓶，30℃，150r/min 培養(yǎng)24h，制得種子液。以5％接種量轉(zhuǎn)接到裝有40 mL 發(fā)酵液的250 mL 三角瓶中，30℃，150r/min 條件下培養(yǎng)48h。發(fā)酵液于8000r／min 離心15min，取上清液測(cè)定酶活力[6、7]。
　　
　　1.3 酶活力測(cè)定方法脂肪酶的活力測(cè)定采用分光光度計(jì)法[8]。在刻度試管中加入1mM p-NPP 溶液lmL 和50mM Tris-HCL 緩沖液(pH8.0)lmL，兩者充分混勻后于38℃水浴中保溫5min，向測(cè)定管加入適當(dāng)稀釋的待測(cè)酶液0.1mL，以加熱滅活的待測(cè)酶液作為空白對(duì)照,反應(yīng)15min 后快速取出，定容至7.5mL 于分光光度計(jì)4l0nm 下測(cè)定酶催化產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚（pNP）的吸光值。脂肪酶 1 個(gè)酶活力單位的定義(U)：在上述條件下，每分鐘水解p-NPP 產(chǎn)生1μmol 對(duì)硝基苯酚(pNP)所需的酶量。
　　
　　1.4 單因素實(shí)驗(yàn)
　　1.4.1 最適碳源篩選分別以 1%的葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、橄欖油+葡萄糖（3：2）代替初始發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，其他成分不變，配制成不同碳源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，發(fā)酵后進(jìn)行酶活測(cè)定。以初始培養(yǎng)基中橄欖油的酶活為100%[10]。
　　1.4.2 最適氮源篩選以可溶性淀粉作為碳源，0.5%的酵母膏、酵母膏+蛋白胨（3：2）、蛋白胨、牛肉膏、尿素、NH4NO3、(NH4)2SO4 七種有機(jī)氮源和無機(jī)氮源進(jìn)行最佳氮源的篩選。以初始培養(yǎng)基中酵母膏的酶活作為100%。
　　1.4.3 最適無機(jī)鹽的篩選以可溶性淀粉為碳源，酵母膏和NH4NO3 為復(fù)合氮源，分別以0.5%的K2HPO4、0.1%的MgSO4·7H20、0.25%和0.5%的NaCl 作為無機(jī)鹽進(jìn)行篩選。以K2HPO4 的酶活為100%。
　　
　　1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　1.5.1 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Fractional Factorial Design, FFD)蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）SWWL6 菌株產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵培養(yǎng)基成分主要有可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4·7H20、NaCl 和甲苯，采用6 因素2 水平的1/8 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)為8。擬合出線性方程：
　　Y = a0 + a1X1 + a2X2 + a3X3 + a4X4 + a5X5 + a6X6 (1)式中：X1、X2、X3、X4、X5、X6 分別為可溶性淀粉、酵母膏、NH4NO3、MgSO4·7H20、NaCl 和甲苯的質(zhì)量濃度(g/100mL)，Y 為相對(duì)酶活力(%)，a0、a1、a2、a3、a4、a5、a6 為方程系數(shù)。
　　1.5.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)部分因子實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以擬合的一階模型回歸系數(shù)的符號(hào)和大小來設(shè)計(jì)顯著因素的最陡爬坡方向及步長(zhǎng)，通過使主要因素同時(shí)朝響應(yīng)值增大的方向變化, 進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，找出峰值, 從而逼近最大響應(yīng)區(qū)域。
　　1.5.3 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design,CCD)[9]
　　以相對(duì)酶活作為響應(yīng)值，采用2 因素5 水平的中心組合設(shè)計(jì)對(duì)影響SWWL6 發(fā)酵產(chǎn)酶的2 個(gè)主要影響因素(酵母膏、NH4NO3)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，5 水平的設(shè)計(jì),其中中心點(diǎn)取最陡爬坡實(shí)驗(yàn)最大響應(yīng)值時(shí)的水平值。
　　擬合出一個(gè)二次多項(xiàng)式方程。該方程為描述響應(yīng)變量與自變量的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。�?duì)于2 因子系統(tǒng)，模型可述為：
　　Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b11X1X1+ b12X1X2 + b22X2X2 （2）式中： X1、X2 為部分因子實(shí)驗(yàn)確定對(duì)響應(yīng)值影響顯著的2 種培養(yǎng)基組分的質(zhì)量濃度(g/100mL)，Y 為預(yù)測(cè)響應(yīng)值，即相對(duì)酶活(%)： b0、b1、b2、b11、b12、b22 為方程系數(shù)。用MINITAB 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析，其中回歸系數(shù)的顯著性用t 檢驗(yàn)，數(shù)學(xué)模型方程的顯著性用F(Fischer)檢驗(yàn)評(píng)價(jià)，方程的擬合性由確定系數(shù)R2 確定。
　　
　　1.6 模型驗(yàn)證對(duì)該多元函數(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)單的性狀分析便可確定出其極值點(diǎn)以及取得極值的相應(yīng)的自變量的取值。再按照計(jì)算所得到的參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證模型的可靠性，并確定最后的優(yōu)化結(jié)果。
　　
　　2 結(jié)果與討論
　　
　　2.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響按照 1.4.1 的方法進(jìn)行碳源篩選，結(jié)果如圖1 所示：由圖 1 可知，在供試的六種碳源中，產(chǎn)生耐有機(jī)溶劑脂肪酶相對(duì)酶活力依次為可溶性淀粉＞橄欖油+葡萄糖＞橄欖油＞麥芽糖＞葡萄糖＞蔗糖。可溶性淀粉的效果明顯優(yōu)于其它單一組分的碳源，故選可溶性淀粉為發(fā)酵最適碳源。
　　
　　2.2 最佳氮源的選擇按照 1.4.2 的方法進(jìn)行最佳氮源的選擇，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如所示：顯示的結(jié)果明，有機(jī)氮源中以酵母膏的產(chǎn)酶效果最佳，無機(jī)氮源以NH4NO3 產(chǎn)酶最佳，大多數(shù)微生物更傾向利用有機(jī)和無機(jī)復(fù)合氮源，對(duì)酵母膏和NH4NO3 組成的復(fù)合氮源進(jìn)行了考察，效果優(yōu)于單一的無機(jī)或有機(jī)氮源，因此選用酵母膏和NH4NO3 組成復(fù)合氮源。
　　
　　2.3 無機(jī)鹽的選擇按照 1.4.3 的方法進(jìn)行無機(jī)鹽的選擇，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如所示：無機(jī)鹽組分中，0.1% MgSO4·7H20 和0.25% NaCl 對(duì)產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，Sharma[11]等報(bào)道,往培養(yǎng)基中添加Mg2+有利于大多數(shù)微生物產(chǎn)脂肪酶，而大量的Na+對(duì)產(chǎn)酶有抑制作用，因此，選用0.1% MgSO4·7H20 和0.25% NaCl 復(fù)合物為無機(jī)鹽。
　　故確定以可溶性淀粉為碳源，酵母膏和NH4NO3 為復(fù)合氮源，0.1%的MgSO4·7H20 和0.25%的NaCl 為無機(jī)鹽進(jìn)行下一步的優(yōu)化。
　　
　　2.4 部分因子實(shí)驗(yàn)篩選液體發(fā)酵的顯著因素應(yīng)用部分因子實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基的組成進(jìn)行篩選，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見1。為了統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以對(duì)初始培養(yǎng)基的相對(duì)酶活作為響應(yīng)值。各因素水平編碼值及回歸分析見。
　　R2=99.62%結(jié)果顯示，培養(yǎng)基成分中對(duì)SWWL6 產(chǎn)酶影響較顯著是酵母膏、NH4NO3（置信度≥99%）。
　　且兩者對(duì)產(chǎn)酶均呈現(xiàn)正效應(yīng)。該方程的決定系數(shù)R 為99.62%明回歸方程擬合良好。由顯著因子效應(yīng)可以看出，在原始培養(yǎng)基基礎(chǔ)上逐漸增加酵母膏、NH4NO3 的濃度對(duì)產(chǎn)酶有有利。
　　其他因素對(duì)產(chǎn)酶影響不顯著，維持在低水平。所以選擇酵母膏、NH4NO3 這兩個(gè)因素作為下一步研究對(duì)象。
　　
　　2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)針對(duì)酵母膏、NH4NO3 質(zhì)量濃度進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如所示。由結(jié)果可知，最大產(chǎn)酶區(qū)在第4 次試驗(yàn)附近，故以實(shí)驗(yàn)4 的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。
　　
　　2.6 中心組合設(shè)計(jì)應(yīng)用 MINITAB 軟件設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，采用22 全因子中心組合實(shí)驗(yàn)，共13 次試驗(yàn)。中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平見4, 2 因素5 水平的響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如5所示。
　　2.6.1 響應(yīng)面回歸模型的建立及置信度分析由 MINITAB 軟件擬合得到多項(xiàng)式回歸模型為：Y=344.7-24.4X1 -16.5X2-55.5X1*X1-14.2X1*X2-43.1X2*X2 回歸方程系數(shù)顯著性分析如6 所示,模型方差分析見。
　　R2=98.5%由可知回歸方程的一次項(xiàng)、平方項(xiàng)的系數(shù)和均方差較大，交互項(xiàng)的系數(shù)和均方差較小，說明兩個(gè)因素間交互效應(yīng)較小。結(jié)果明，在α=0. 0001 水平上，該模型失擬不顯著，回歸高度顯著。決定系數(shù)R2 為98.5%，說明模型能解釋98.5%脂肪酶產(chǎn)量的變化,回歸擬合程度較好。該方法為SWWL6 發(fā)酵產(chǎn)耐有機(jī)溶劑脂肪酶提供了一個(gè)合適的模型，因此可用上述模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)脂肪酶發(fā)酵進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。
　　2.6.2 響應(yīng)因子水平的優(yōu)化圖 4 繪制了中心組合響應(yīng)面，以酵母膏和硝酸銨的水平作為平面坐標(biāo)，以脂肪酶相對(duì)酶活作為響應(yīng)值。
　　從響應(yīng)面的立體圖可知，回歸模型存在最大值，最大值的穩(wěn)定點(diǎn)是在（-0.2028，-0.1585），對(duì)應(yīng)的X1、X2 實(shí)際取值為（0.640，0.384），Y 的最大估計(jì)值為348.44。即當(dāng)酵母膏和NH4NO3的濃度為0.640%和0.384%時(shí)，模型預(yù)測(cè)的最大相對(duì)酶活為348.44%此條件下進(jìn)行重復(fù)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，獲得實(shí)際平均產(chǎn)酶活力為347.98%。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間的良好擬合性證實(shí)該模型的有效性。
　　
　　3 結(jié)論
　　
　　本文應(yīng)用部分因子設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)Bacillus cereus SWWL6 發(fā)酵產(chǎn)酶營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行快速、有效優(yōu)化。優(yōu)化后培養(yǎng)基的組成為：淀粉1%，酵母膏0.64%，NH4NO30.384%，MgSO4·7H200.1%，NaCl 0.25%。在優(yōu)化條件下?lián)u瓶發(fā)酵48h 產(chǎn)脂肪酶是優(yōu)化前的3.48 倍。

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