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氨氧化微生物對(duì)土壤氮循環(huán)的貢獻(xiàn)及其影響因素論文
硝化作用在土壤氮轉(zhuǎn)化過(guò)程中是一個(gè)非常重要的步驟，它關(guān)系到外源銨態(tài)氮和礦化釋放的氮在土壤氮循環(huán)中的轉(zhuǎn)化以及土壤氮的損失。所涉及的過(guò)程關(guān)聯(lián)著土壤的酸化、水體的富營(yíng)養(yǎng)化以及溫室氣體 N2O 的排放等環(huán)境問(wèn)題[1].因此，硝化作用一直是氮轉(zhuǎn)化過(guò)程中一個(gè)備受關(guān)注的環(huán)節(jié)。
氨氧化作用是硝化作用的第一步反應(yīng)，也是限速步驟[2],其主要驅(qū)動(dòng)者是氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizing bacteria,AOB）和氨氧化古菌（Ammonia -oxidizing archaea,AOA），因此對(duì)它們的研究引起了廣泛的關(guān)注。
1 系統(tǒng)發(fā)育地位。
1.1 氨氧化細(xì)菌。
氨氧化細(xì)菌普遍存在于土壤、地表水和沉積物中，還被發(fā)現(xiàn)在建筑沙石、蘇打以及南極冰層等一些極端的生態(tài)環(huán)境中也有存在。Woese 等[3]基于16S rRNA 結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩類在系統(tǒng)發(fā)育上明顯不同的類別組成了氨氧化細(xì)菌：一類是屬于變形菌門(mén) （Proteobacteria），包含海洋硝化球菌（Nitroso-coccus oceanus） 的 γ - 亞綱；另一類也是屬于變形菌門(mén)，包含活動(dòng)硝化球菌（Nitrosococcus mobilis） 的β 亞綱。變形菌門(mén)的 β 亞綱又包含 3 個(gè)分支：其一是 Nitrosococcus mobilis;其二是歐洲亞硝化單胞菌 （Nitrosomonas europaea）；其三是亞硝化螺旋菌（Nitrosospira） 、亞硝化葉菌（Nitrosovibrio） 和亞硝化弧菌（Nitrosolobus）。Head 等[4]在基于 16S rRNA 的核苷酸序列對(duì) AOB 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)開(kāi)展同源性比較時(shí)，將亞硝化弧菌、亞硝化螺旋菌亞和硝化葉菌都?xì)w類到亞硝化螺旋菌屬。分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析表明，陸地生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)種群 Nitrosospira 和Nitrosomonas 可以分成 9 個(gè)不同的系統(tǒng)發(fā)生簇（cluster）。
1.2 氨氧化古菌。
在系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化方面，AOA 形成了一類完全獨(dú)立于 AOB 的進(jìn)化分支。基于 16SrRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明，聚類在泉古菌的不同 AOA 分支其生態(tài)來(lái)源也不同：聚類于 Group 1.1a 的 AOA來(lái)源于海洋、大部分水體和沉積物；聚類于 Group1.1b 的 AOA 來(lái)源于土壤及其它陸地環(huán)境�；赼moA 基因，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上嗜高溫 AOA 獨(dú)立于海洋和土壤分支。基于 16S rRNA 基因和 AOA 的amoA 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，二者能很好地重合。除此之外，Group 1.1c 類群也被發(fā)現(xiàn)，并認(rèn)為它們可能也參與了氨氧化過(guò)程，但目前還沒(méi)有找到相應(yīng)的 amoA 序列[5].
2 氨氧化微生物對(duì)土壤氮循環(huán)的相對(duì)貢獻(xiàn)。
研究表明，雖然地球環(huán)境中存在大量的氨氧化古菌和氨氧化古菌的 amoA 基因，但并不說(shuō)明該基因一定會(huì)在驅(qū)動(dòng)氨氧化過(guò)程中發(fā)揮作用[6].
2.1 氨氧化細(xì)菌在堿性土壤中的主導(dǎo)作用。
在中性和堿性土壤中，施肥尤其是高量氮肥的施入，顯著改變了 AOB 的群落組成，并且數(shù)量也有增加，但對(duì) AOA 卻沒(méi)有顯著影響。暗示 AOB在這些土壤中更加“活躍”.Shen 等[7]對(duì)河南封丘長(zhǎng)期定位試驗(yàn)站中堿性潮土（pH=8.3~8.7）的研究中發(fā)現(xiàn)，不同施肥處理下 AOB 的數(shù)量均顯著低于AOA,但不同施肥處理僅導(dǎo)致 AOB 群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，對(duì) AOA 的群落組成并沒(méi)有產(chǎn)生明顯的影響，而且只有 AOB 的豐度與與土壤硝化潛勢(shì)呈顯著正相關(guān)。推測(cè)在這些堿性潮土中主要是 AOB 對(duì)土壤硝化作用產(chǎn)生貢獻(xiàn)。同樣地，在對(duì)新西蘭高氮草地土壤的研究中，Di 等[8]也發(fā)現(xiàn)施氮肥增加了AOB 的豐度和土壤的硝化強(qiáng)度，這種增加可被硝化抑制劑 DCD 明顯抑制，對(duì) AOA 卻沒(méi)有明顯的影響。
利用 DNA-SIP 技術(shù)，Xia 等[9]研究發(fā)現(xiàn)在河南封丘堿性潮土中，只有 AOB 參與了氨氧化過(guò)程和13CO2的固定，AOB 在該土壤硝化作用中發(fā)揮了主導(dǎo)作用。Jia and Conrad[10]在對(duì)德國(guó)中性農(nóng)田土壤進(jìn)行研究時(shí)僅發(fā)現(xiàn) AOB 能夠同化 CO2,推測(cè)AOA 可能并沒(méi)有參與土壤的硝化過(guò)程，或者因AOA 只是利用了極少量的 13CO2而沒(méi)能分離到足夠量的標(biāo)記 DNA,認(rèn)為 AOB 是該土壤硝化作用的主要貢獻(xiàn)者。同樣，Jiang 等[11]發(fā)現(xiàn)在堿性水稻土壤（pH=8.0）中硝化作用的主導(dǎo)者也是 AOB（Nitrosospira Cluster 3）。Wang 等[12]在對(duì)江西玉米地長(zhǎng)期定位施肥土壤進(jìn)行 DNA-SIP 研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不施肥對(duì)照、施 N 肥和 NPK 肥的土壤 pH 值為酸性，AOA 在同化 CO2的過(guò)程中占據(jù)了主導(dǎo)地位；而長(zhǎng)期施有機(jī)肥的土壤 pH 值接近中性，主要是AOB 參與了 CO2的同化。
2.2 氨氧化古菌在酸性土壤中的主導(dǎo)作用。
He 等[13]通過(guò)對(duì)湖南祁陽(yáng)旱地肥力及肥料效應(yīng)長(zhǎng)期定位試驗(yàn)點(diǎn)紅壤的研究中發(fā)現(xiàn)，土壤 pH值（pH= 3.7~5.8）因長(zhǎng)期施用氮肥而顯著降低，在8 個(gè)不同施肥處理中，AOB 的數(shù)量均顯著低于AOA.不同施肥處理對(duì)土壤總細(xì)菌數(shù)量的影響并不明顯，但顯著影響了 AOA 和 AOB 的數(shù)量；而且AOB 的群落組成在各處理之間沒(méi)有顯著差異，AOA 的群落組成差異卻非常明顯[14].這表明 AOA的豐度和群落組成對(duì)長(zhǎng)期施肥導(dǎo)致的土壤理化性質(zhì)的變化所產(chǎn)生的響應(yīng)比 AOB 更明顯。而且，AOB 和 AOA 的豐度與土壤硝化潛勢(shì)呈顯著正相關(guān)，推測(cè)酸性土壤中 AOB 和 AOA 對(duì)土壤硝化作用可能都有貢獻(xiàn)。另有對(duì)我國(guó)南方酸性土壤中AOB 和 AOA 群落組成調(diào)查的研究結(jié)果[15 -16]也支持了這一推測(cè)。這些土壤中僅 AOA 的數(shù)量與土壤硝化潛勢(shì)呈正相關(guān)，與 AOB 的數(shù)量并沒(méi)有關(guān)系；而且茶園土壤中 AOA 與 AOB 的數(shù)量之比隨 pH值的降低而增加。這些結(jié)果表明：在酸性土壤氨氧化作用中，AOA 可能比 AOB 更加活躍。應(yīng)用基于 DNA 分析的穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)（DNA-SIP） ,Zhang 等[17]根據(jù)氨氧化微生物氧化氨的同時(shí)固定 CO2進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)這一原理，加入13C 標(biāo)記的 CO2作為底物對(duì)土壤（pH=3.7）進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)“活躍的”氨氧化微生物是 AOA 中的Group 1.1a-associated 類群，在氨氧化過(guò)程中發(fā)揮了主導(dǎo)作用，同化了 13CO2進(jìn)行了生長(zhǎng)，并且氨氧化速率與 AOA 的 amoA 基因豐度呈顯著正相關(guān)，但在 AOB 中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。另外，Lu 等[18]的研究結(jié)果同樣表明 Group 1.1a-associated 類群是氨氧化作用的主要執(zhí)行者。Wang 等[19]在研究另一種酸性農(nóng)田土壤時(shí)發(fā)現(xiàn)氨氧化作用的執(zhí)行者是Group 1.1b 類群。以上結(jié)果表明，氨氧化古菌主導(dǎo)了這些酸性土壤中的硝化作用。
AOA 在酸性環(huán)境中發(fā)揮主要功能的可能機(jī)理包括[20]:（1） AOA 對(duì) NH3的親和力更高[21],因此，在低濃度 NH3的環(huán)境中更容易生長(zhǎng)。酸性土壤的pH 值較低，其中的氨多以 NH4+的形態(tài)存在，NH3濃度較低，更適于對(duì) NH3親和力較高的 AOA 生長(zhǎng)。（2）很多研究表明，與無(wú)機(jī)氮相比，AOA 的生長(zhǎng)更易受有機(jī)氮的刺激，自養(yǎng)生長(zhǎng)所利用的主要是有機(jī)質(zhì)礦化所釋放的低濃度 NH3.另外，AOA也可能是混合營(yíng)養(yǎng)型生長(zhǎng)，直接利用土壤中的有機(jī)碳源[22].因此，AOA 比 AOB 具有更大的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。（3）AOA 與 AOB 相比其生理生化和遺傳特征更加獨(dú)特，通過(guò)對(duì)幾株純培養(yǎng)的 AOA 基因組學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)，AOA 和 AOB 的氨氧化途徑可能顯著不同，而且 AOA 的氨氧化和碳固定過(guò)程能量的消耗明顯減少，有助于它們?cè)谝恍┎焕沫h(huán)境中發(fā)揮作用[23].
酸性土壤中 AOA 占主導(dǎo)與堿性和中性土壤中 AOB 占主導(dǎo)的研究結(jié)果，支持了這樣一種猜測(cè)：兩類氨氧化微生物的生態(tài)位具有明顯的分化特征[24].即在中性和堿性土壤中，AOB 發(fā)揮了功能活性；在低氮、強(qiáng)酸性和高溫等較苛刻的環(huán)境中AOA 是硝化作用的主要驅(qū)動(dòng)者。近來(lái)從英國(guó)蘇格蘭酸性土壤中成功富積培養(yǎng)到的一株嗜酸氨氧化古菌 Nitrosotalea devanaterra,其適宜的生長(zhǎng) pH 值為 4.0~5.0,當(dāng) pH>5.5 時(shí)生長(zhǎng)受抑制[25],更進(jìn)一步證實(shí)了以上觀點(diǎn)。
3 環(huán)境因子對(duì)氨氧化微生物的影響。
土壤擁有非常復(fù)雜的環(huán)境體系，其理化性狀決定著土壤中微生物群落的數(shù)量和分布。土壤氨氧化微生物的分布除了與土壤養(yǎng)分狀況緊密相關(guān)[26],還與土壤 pH 值[27]、NH3濃度[28]、土壤管理方式[29]和植被[30]等有很大的關(guān)系。
3.1 pH 值。
硝化作用底物的生物可利用性和化學(xué)形態(tài)均受土壤 pH 值影響，同時(shí) pH 值也影響 AOB 和AOA 的生長(zhǎng)和功能活性，進(jìn)而影響它們對(duì)硝化作用的相對(duì)貢獻(xiàn)[31].隨著農(nóng)田土壤硝化作用的不斷加強(qiáng)，顯著降低了土壤的 pH 值，AOA 的 amoA 豐度明顯下降，表明 pH 值可能是影響土壤 AOA 數(shù)量的重要環(huán)境因子[32].另有研究表明，在 pH=8.3~8.7 的堿性土壤[33]和 pH=3.7~6.0[34]的酸性土壤中AOA 的 amoA 基因豐度與 pH 值也呈現(xiàn)較好的負(fù)相關(guān)。但是也有研究表明，AOA 的 amoA 基因豐度隨著土壤 pH 值的升高而增加[35],或者沒(méi)有顯著變化[36].Gubry-Rangin 等[37]認(rèn)為 pH 值是唯一測(cè)量到的顯著影響 AOA 群落和結(jié)構(gòu)的土壤理化性質(zhì)。在酸性土壤中，相對(duì)豐度較高的 AOB 是 Nitrosospiracluster 2[38];而 Carnol 等[39]證明，在高氮負(fù)荷的酸性褐色土壤中 AOB 的群落是以 Nitrosomonas eu-ropaea 為主。
一般認(rèn)為，在 pH 值<6.5 的環(huán)境中 AOB 不易生長(zhǎng)，其適宜生長(zhǎng)的 pH 值范圍為 7.0~8.5.Yuan等[40]和 Zhang 等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，在紅壤 pH 值比較低的條件下對(duì)氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)具有選擇性。另外，研究發(fā)現(xiàn)酸性和堿性土壤中氨氧化微生物的活性存在著明顯差異。He 等認(rèn)為在酸性紅壤中，氨氧化勢(shì)與 AOA 的豐度呈正相關(guān)，而與 AOB的豐度無(wú)關(guān)；相反地，Shen 等[7]在研究中性和堿性土壤時(shí)發(fā)現(xiàn)，氨氧化勢(shì)與 AOB 的豐度呈正相關(guān)。Hu 等[42]通過(guò)高通量測(cè)序，認(rèn)為 pH 值最能解釋AOA 和 AOB 的生態(tài)位分異；Wang 等[12]利用 DNA-SIP 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期定位施肥改變了土壤的 pH值，“活躍的”氨氧化微生物群體也發(fā)生了變化。
3.2 土壤中 NH3的濃度。
氨的氧化為緩慢生長(zhǎng)的硝化微生物提供唯一的能量，因此氨介質(zhì)的可利用性被認(rèn)為是 AOA 和AOB 不同生態(tài)分異的主要影響因素[43].以前的研究表明，一些含氨量很低的生態(tài)系統(tǒng)中，也有未知的氨氧化微生物出現(xiàn)，因?yàn)樵粭l件下氨介質(zhì)的濃度顯著低于 AOB 的生長(zhǎng)需要[44].同樣，在調(diào)查不施肥、施礦質(zhì)肥和礦質(zhì)肥加有機(jī)肥時(shí)，發(fā)現(xiàn)amoA 基因拷貝數(shù)的 AOA 與 AOB 之比在不施肥土壤中最高[45].研究表明，在大量施肥的土壤或者濕地中 AOB 豐度和硝化強(qiáng)度顯著正相關(guān)；而且AOA 的生長(zhǎng)受到高水平氨的抑制[46].
在當(dāng)前研究中從陸地或者海洋生態(tài)系統(tǒng)中培養(yǎng)或者富集古菌的抑制濃度是 0.89~356 μmol·L-1,遠(yuǎn)低于 AOB 的可培養(yǎng)濃度 394~40 000 μmol·L-1.這表明 AOA 具有更低更窄的介質(zhì)生長(zhǎng)范圍。被富集的 AOA 的 Km 值僅為 0.61~0.69[47].相比較來(lái)說(shuō)可培養(yǎng) AOB 的 Km 常數(shù)是 50~1 780 μmol·L-1,因此 AOA 具有更高的 NH3親和力，大于可培養(yǎng)AOB 的 200 多倍[48].說(shuō)明 AOA 在 pH 值較低的低氨環(huán)境中相比 AOB 有更大的競(jìng)爭(zhēng)能力。
3.3 溫 度。
合適的溫度對(duì)于生物酶催化新陳代謝非常關(guān)鍵，從而影響 AOA 和 AOB 的組成和活性等。U-rakawa 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，較低的溫度會(huì)使 AOB 的數(shù)量和多樣性降低。Avrahami 等人[50]發(fā)現(xiàn)，在中溫（10~25 ℃）時(shí) AOB 的硝化潛勢(shì)最高，低溫（4 ℃）或高溫（37 ℃）時(shí)會(huì)顯著降低。在年平均氣溫差異非常明顯的土壤中，酸性土壤（pH=5.0~5.8）中 AOB的物種組成有差異，優(yōu)勢(shì)物種也不相同；弱堿性土壤中只有 Nitrosospira cluster 3a 隨溫度發(fā)生變化，且 Cluster 3a 只在高溫低肥的土壤中存在。在水簇箱過(guò)濾系統(tǒng)中，溫度較低時(shí)，AOA 多樣性也低[49].Tourna 等[51]進(jìn)行微生態(tài)系統(tǒng)培養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，設(shè)計(jì)了不同的溫度（10~30 ℃，5 ℃為一梯度）梯度，對(duì)其進(jìn)行 DGGE 群落結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，AOA 群落結(jié)構(gòu)在不同培養(yǎng)溫度下差別較大。
3.4 通氣與水分條件。
大部分的氨氧化微生物屬于好氧自養(yǎng)型微生物，需要在 O2的參與下完成氧化 NH4+產(chǎn)生 ATP的過(guò)程。氧分壓與含水量呈負(fù)相關(guān)性，過(guò)低和過(guò)高的含水量對(duì)土壤硝化作用均有不利的影響。含水量高時(shí)土壤中氧氣含量低，對(duì)硝化微生物的代謝不利；含水量低時(shí)土壤中的氧氣可以完全充滿土壤，但干燥的土壤環(huán)境對(duì)硝化微生物的存活不利[52].
一般情況下認(rèn)為，田間最大持水量（WHC）的 50%~70%為最適合硝化作用的土壤含水量[53].在研究稻田土壤的硝化作用時(shí)發(fā)現(xiàn)：土壤的氧負(fù)壓決定著淹水土壤中硝化作用是否存在，硝化微生物能否繁殖和存活；在一定范圍內(nèi)，硝化作用在低氧化還原電位條件下仍然可以進(jìn)行；當(dāng)硝化細(xì)菌的活性不被 NH4+濃度所限制時(shí)，土壤硝化作用強(qiáng)度隨著淹水層 O2濃度的增加而顯著增強(qiáng)[54].稻田根際土壤與非根際土壤相比常常具有較高的氧化還原電勢(shì)，AOB 的 amoA 基因數(shù)量在非根際土壤和根際土壤中變化不明顯，但是非根際土壤 AOA amoA基因的拷貝數(shù)顯著低于根際土壤，AOA 與 AOB 的amoA 基因比值在 1. 2~69. 3 的范圍內(nèi)波動(dòng)[55].
4 結(jié)論與展望。
氮循環(huán)過(guò)程中 AOB 和 AOA 的貢獻(xiàn)問(wèn)題一直是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，與生態(tài)因子的改變密切相關(guān)。利用同位素示蹤技術(shù)能準(zhǔn)確定位 AOB 和AOA 的生態(tài)功能，明確 AOB 和 AOA 在氨氧化作用中的相對(duì)貢獻(xiàn)，具有重要的生態(tài)環(huán)境和生物進(jìn)化意義。今后應(yīng)盡可能地分離、篩選不同生態(tài)環(huán)境條件下的氨氧化微生物，研究它們生理生態(tài)功能和生化特征，進(jìn)一步深化對(duì)硝化作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
另外，還應(yīng)從大尺度上研究土壤氨氧化微生物群落分布和功能的特點(diǎn)，進(jìn)一步明確其時(shí)空演變特征和驅(qū)動(dòng)氨氧化微生物生態(tài)位分異的主要環(huán)境因子。除此之外，今后研究的重點(diǎn)還有評(píng)估氨氧化微生物在硝化過(guò)程中的作用，包括對(duì)溫室氣體 N2O釋放的貢獻(xiàn)和其他可能的生態(tài)功能等。
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