細胞培養(yǎng)中的微生物污染及防控對策的論文
細胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對細胞生存有害的成分和造成細胞變異的異物。體外細胞污染可分為3類： 物理性、化學性、生物性污染[1].其中生物性污染常見且造成的后果也較為嚴重，培養(yǎng)的細胞一旦遭到微生物污染，將具有不可逆轉性，輕則污染細胞廢棄，重則連帶污染培養(yǎng)箱內的其他細胞，甚至整個實驗室的環(huán)境，給科研工作帶來嚴重的損失和威脅。以下對細胞培養(yǎng)過程中常見的微生物污染及防控作以介紹。
1 細菌污染
細菌污染特點為污染速度快，易被發(fā)現(xiàn)。細菌污染后，培養(yǎng)基1 ~ 2 d就會變渾濁，對細胞生長影響明顯[2],p H值改變[3].常見細菌種類為大腸桿菌、枯草桿菌、假單胞菌等（ 革蘭陰性菌） 葡萄球菌等（ 革蘭陽性菌）[4-5],其中革蘭陽性菌較為多見[6],利用此特點可指導抗生素的應用。污染主要來源實驗室環(huán)境、實驗人員（ 實驗服）、實驗用具等[4].污染后的鏡下特點為： 胞漿出現(xiàn)大量顆粒，細胞變圓或崩潰，從壁上脫落，污染較輕時可見小菌體在細胞間運動[5].
疑細菌污染后，可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實細菌種類； 有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物 的 培 養(yǎng) 液 接 種，也 可 取10 m L細 胞 懸 液 以100 rpm離心5 min,沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2 m L,置于37 ℃培養(yǎng)，24 h可得結果。確定污染后，若想進行挽救可在細菌污染培養(yǎng)液中添加雙抗（ 青鏈霉素）、西司他丁鈉+亞胺培南消除細菌污染[4,7].
2 霉菌污染
霉菌污染特點為短期內不會引起培養(yǎng)液的渾濁，可在培養(yǎng)液中形成白色或黃色漂浮物。污染的主要來源為實驗人員（ 實驗服）[5].污染后的鏡下特點為： 低倍鏡下可見乳白色的團狀漂浮物，培養(yǎng)液無變化； 高倍鏡下可見明顯的.菌絲，細胞活力變差，生長速度明顯變慢，甚至死亡[8].
疑有霉菌污染的細胞可離心后經PAS染色進行霉菌鏡檢，同時進行霉菌培養(yǎng)以確定污染及鑒定霉菌種類[9].霉菌污染初期，在培養(yǎng)液中可見漂浮的菌絲，這時將污染的細胞培養(yǎng)液慢慢吸出，用Hanks液清洗細胞及瓶壁2 ~ 3次，加入含有以下抗生素的培養(yǎng)液，即青霉素100單位/m L,鏈霉素100單位/m L,兩性霉素10 mg /L,24 h后觀察換液，若仍有菌絲可重復上述步驟進行處理，2 ~ 3次后就基本得到控制[8].但經此種方式處理后對細胞的生長影響也較大。另有報道低速離心法可清除霉菌污染，方式簡單對細胞影響小[9].但建議一般出現(xiàn)霉菌污染，如果不是非常珍貴的細胞一般都是扔掉，而且連相關的容器都要做嚴格的處理。
3 支原體污染
支原體污染的特點為短期無變化，具有隱蔽性。它們可以與細胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常的感覺。如果繼續(xù)使用這種已被支原體污染而貌似正常的細胞做試驗或生產，將會嚴重影響結果[1].污染的主要來源為血清[4].污染后鏡下特點： 在光鏡下常可見到細胞核及胞漿內出現(xiàn)大小不等的顆�；蚩张輀10].
目前實驗室檢查支原體污染的金標準為DNA熒光染色法結合直接培養(yǎng)法[11],主要輔助檢測方法有PCR法、顯 微鏡法等[12-16],其他方法有滾環(huán)擴增技術[17]、瓜氨酸測定法[18]、免疫熒光抗體法、放射自顯影法[19]等。相對于其他污染的檢測，支原體污染的檢測方法雖多，但在價格及特異性方面差異很大，應根據(jù)實驗需要及實驗條件進行選擇。支原體的清除一般不宜用抗生素，因其對抗生素不敏感，主要的清除方法有抗血清處理法、高溫處理法、小鼠腹腔巨噬細胞清除法、選擇性殺滅哺乳動物類細胞培養(yǎng)物中支原體的方法，其中小鼠腹腔巨噬細胞清除法效果較好，方法是將支原體污染的細胞注射到小鼠腹腔。經24 h或48 h后，將小鼠腹水抽出（ 腹水已含注入的細胞） ,經離心后收集細胞于培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)[19].因在日常細胞培養(yǎng)過程中支原體的污染常被忽視，為了避免損失可 定 期 對 實 驗 室 中 的 培 養(yǎng) 物 進 行 支 原 體 檢測[20].
4 病毒污染
病毒污染特點是極為隱蔽，很難用常規(guī)的方法檢測到[21].受病毒污染的細胞液通常清亮無變化。污染分為外源性和內源性[19,22],污染的主要來源為細胞系，常見于雜交瘤細胞[4].大多數(shù)受病毒污染的細胞不會產生形態(tài)變化及細胞病理現(xiàn)象[19],少部分病毒會造成細胞變圓、腫脹，脫落[21].
疑病毒污染后，可用血細胞吸附試驗、免疫熒光抗體法及電子顯微鏡法有效檢出病毒[19].通常病毒物污染的清除是十分困難的，可以重新引入高質量的細胞株。
5 黑膠蟲污染
黑蛟蟲是一種生物還是非生物，學術界還有爭論。其污染特點為開始對細胞無影響，當數(shù)量達到一定程度時就會對細胞產生影響[23].受黑蛟蟲污染的細胞液通常清亮無變化。污染主要來源于血清，400倍顯微鏡下可見點狀或片狀游動小體。
黑蛟蟲早期污染一般采用如下方法： 用0. 25%的胰酶消化，當有少量細胞變圓或脫壁時，用血清終止消化，輕輕用培養(yǎng)基或D-Hanks液清洗3遍（ 緩慢流過細胞表面） ,不要吹打，然后吹散細胞，換培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，隔天換液。2 d后重復一次，以后每24 ~ 36 h換1次液，1周后，黑點可基本消失。也可用麥諾霉素10 mg /L處理，連續(xù)1周，但麥諾霉素對細胞有毒性[23].
6 細胞的交叉污染
細胞的交叉污染一般來自細胞建株和細胞傳代過程中兩種或兩種以上細胞之間的污染[19].鏡下可發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)發(fā)生改變，與正常該細胞株的形態(tài)不同。
關于細胞系的種系來源可以通過各種免疫學試驗、同功酶分析及細胞遺傳學方法來確定。其中以熒光抗體染色法和同功酶譜系分析法應用較廣泛。同功酶分析法不僅可以鑒別細胞種屬，而且可以鑒別種內細胞的交叉污染[19].若發(fā)生細胞的交叉污染，通常不能挽回，只能放棄細胞。為避免細胞的交叉污染，在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分，最好做上標記便于辨別。并按順序進行操作，避免一起進行時發(fā)生混亂。在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞[23].
7 結 語
細胞一旦發(fā)生污染，任何一種挽救細胞的處理可能都會對細胞產生不良或未知的影響，因此如果不是不易獲得的細胞，實驗者都應該抱著嚴謹平和的態(tài)度重新開始。細胞培養(yǎng)中污染的來源主要有以下幾種途徑：1） 細胞組織本身帶有污染；2） 實驗室內空氣不潔凈；3） 實驗操作者未能嚴格遵守操作規(guī)程；4） 生物安全柜不潔凈或使用不正確；5） 實驗中所用的器具和培養(yǎng)基消毒不徹底。因此實驗者應從以上幾方面盡量避免細胞污染，才能保證實驗的有序進行。
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