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綿羊PTGER3基因生物信息學(xué)分析論文
前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）是一種二十碳不飽和脂肪酸。目前，畜牧生產(chǎn)上將該激素主要用作待產(chǎn)母畜的催產(chǎn)素，在同期發(fā)情技術(shù)上也有應(yīng)用。實(shí)際上，前列腺素E2在體內(nèi)分布廣泛，不僅僅是參與機(jī)體平滑肌的收縮，還參與炎癥反應(yīng)的炎性遞質(zhì)，干細(xì)胞增殖分化，而且在骨組織形成與改建過程中也有非常重要的調(diào)節(jié)作用[1]。前列腺素E受體3基因（Prostaglandin E receptor 3，PTGER3）編碼前列腺素E2受體EP3蛋白[2]。EP3蛋白是前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）的受體中的一種亞型，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族（G-protein coupled receptors，GPCRs）[3]。G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員龐大，主要通過結(jié)合和調(diào)節(jié)細(xì)胞G蛋白活性完成細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，是細(xì)胞重要的代謝門控。此外，部分GPCRs參與細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化炎癥變態(tài)等機(jī)體反應(yīng)，具有重要的生物學(xué)意義[3-5]。根據(jù)G蛋白偶聯(lián)信號傳導(dǎo)理論，前列腺素E2需要與前列腺素E2受體EP3蛋白結(jié)合，EP3蛋白與多種G蛋白偶聯(lián)，才能將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)為細(xì)胞內(nèi)信號。
本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)相關(guān)網(wǎng)頁和軟件對綿羊的PTGER3基因進(jìn)行理論分析，預(yù)測綿羊PTGER3基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，對實(shí)際生產(chǎn)科學(xué)應(yīng)用前列腺素E2提供指導(dǎo)，為下一步羊的PTGER3基因重組實(shí)驗(yàn)提供幫助，為未來PTGER3基因檢測技術(shù)對綿羊進(jìn)行選育提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)序列材料來源于美國國家生物信息中心（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），下文簡稱為NCBI。本研究選用綿羊（XM_012173631.2）、山羊（XM_018045482.1）、牛（NM_181032.1）、人（XM_011541810.2）、家鼠（XM_011240037.1）、狗（NM_001002958.1）、豬（XM_013988866.1）和雞（NM_001040468.1）8個(gè)物種的mRNA序列。括號內(nèi)為NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫的登錄號。
1.2 試驗(yàn)方法
綿羊PTGER3基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF）利用NCBI網(wǎng)頁中的ORF Finder程序?qū)ζ鋗RNA序列進(jìn)行識別預(yù)測分析；PTGER3基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)采用ExPASy在線預(yù)測；對編碼產(chǎn)物的位置分布采用PSORTⅡ亞細(xì)胞定位分析預(yù)測；編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)功能分析采用是ProtFun網(wǎng)頁預(yù)測；跨膜區(qū)域預(yù)測分析采用信號肽網(wǎng)頁在線分析；二級結(jié)構(gòu)采用Jpred網(wǎng)頁預(yù)測；利用DNAMAN軟件對試驗(yàn)序列的同源性進(jìn)行分析比較。
2 結(jié)果與分析
2.1 綿羊PTGER3基因的ORF分析
開放閱讀框（Open reading frame，ORF）是一段可編碼蛋白質(zhì)的，中間無終止序列打斷從啟動子到終止子的堿基序列。通過識別ORF可以快速識別出基因序列中的編碼區(qū)域。圖1為綿羊PTGER3基因的開放閱讀框的結(jié)果，可知此序列中共識別有12個(gè)開放閱讀框，其中最大的開放閱讀框長度為1 239 bp，分析是由412個(gè)氨基酸構(gòu)成了該編碼產(chǎn)物的。
2.2 綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物序列同源性分析
由圖2可以看出，研究對照的8個(gè)物種中均表達(dá)有PTGER3基因。尤其綿羊、牛的序列同源性高，因此推測這2個(gè)物種的親緣關(guān)系較近。根據(jù)圖3的PTGER3基因編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，綿羊、牛同源性遠(yuǎn)高于其他物種，其親緣相似性到達(dá)了99%；此外，綿羊與山羊的系統(tǒng)發(fā)育的距離很近，其親緣相似性達(dá)到了92%。
2.3 綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析
氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，圖4是預(yù)測綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物的氨基酸組成的分析圖，結(jié)果表明，其編碼產(chǎn)物的理論分子量約為45 568.48 Da，其等電點(diǎn)為9.49，編碼的421個(gè)氨基酸中，含有色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，可知該編碼產(chǎn)物可以利用280 nm的光吸收值進(jìn)而預(yù)測分析溶液中的蛋白含量。此外，從氨基酸組成上發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)類氨基酸占全部氨基酸的51.8%，其中脂肪族類∶芳香族類為190∶67。該蛋白還富有羥基和含硫氨基酸，所占比例分別為16.8%和7.3%。
2.4 綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物亞細(xì)胞定位分析
綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位結(jié)果如表1所示，PTGER3基因編碼產(chǎn)物主要表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其可能性為66.7%，同時(shí)在高爾基體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的分布概率均占11.1%。由此可以推斷該基因產(chǎn)物作用比較專一，在細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、線粒體中發(fā)揮生物學(xué)作用，可能參與調(diào)控細(xì)胞中輔助因子合成、中間代謝產(chǎn)物的合成以及能量代謝的生命活動。
2.5 綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)功能預(yù)測與分析
結(jié)構(gòu)域是二級蛋白序列片段經(jīng)過盤曲折疊形成的超二級結(jié)構(gòu)，不同的結(jié)構(gòu)域具有不同的特定的功能作用。通過分析PTGER3編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)可有效預(yù)測基因PTGER3編碼產(chǎn)物的功能。從表2可得知，PTGER3主要具有調(diào)控功能、輔助因子生物合成、能量代謝和代謝中間產(chǎn)物的功能，可能性分別為0.530、0.133、0.087和0.046，由此推斷PTGER3作為運(yùn)載體在信號傳導(dǎo)、能量調(diào)控和分泌蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
2.6 綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物信號肽預(yù)測與分析
信號肽序列是存在于分泌蛋白基因編碼序列中，在起始密碼子之后的一段富含疏水氨基酸多肽的序列。通過檢測綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物信號肽的存在情況，可以得知編碼產(chǎn)物是否是分泌蛋白和跨膜蛋白以及跨膜蛋白的基本信息。由圖5可知，綿羊PTGER3蛋白氨基酸C值為1，Y值為1，S值為1。表明PTGER3基因的編碼產(chǎn)物不存在信號肽，是非分泌性蛋白；未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)，該蛋白是非跨膜蛋白。
2.7 綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測與分析
Jpred是一款利用已知氨基酸序列推測其蛋白二級結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)系統(tǒng)。通過預(yù)測綿羊PTGER3基因產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)，分析后結(jié)果如圖6所示。綿羊PTGER3基因編碼產(chǎn)物從N端的第50個(gè)氨基酸才開始出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，即第50位的絲氨酸處形成第一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。PTGER3蛋白二級結(jié)構(gòu)按照αααααββαααααααα順序排列，其中共由13個(gè)α螺旋、2個(gè)β折疊。
3 討論
本試驗(yàn)選取登記在NBCI數(shù)據(jù)庫中豬、馬、牛、山羊和綿羊等物種的PTGER3基因序列，利用生物信息學(xué)方法對綿羊PTGER3基因分析其編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能。生物信息學(xué)是利用數(shù)學(xué)方法處理和分析生物數(shù)據(jù)，基于人們現(xiàn)有對分子生物學(xué)的認(rèn)識和構(gòu)建生物模型，進(jìn)而分析其生物學(xué)特性的方法。如根據(jù)不同核糖核苷酸序列估計(jì)其氨基酸組成、蛋白的結(jié)構(gòu)和功能等。利用基因數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析相關(guān)基因及其編碼產(chǎn)物，是當(dāng)前功能基因組學(xué)的重要研究手段。其明顯優(yōu)于過去的單一基因研究模式，可以在基因組、分子的水平對基因的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)全面的分析[6]。
4 結(jié)論
�、傺芯拷Y(jié)果顯示，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，綿羊、牛和山羊的PTGER3基因的同源性高于其他物種。
②通過分析綿羊的PTGER3基因序列編碼產(chǎn)物的氨基酸的組成，得知分子量為45 568.48 Da，其等電點(diǎn)為9.46，是堿性蛋白質(zhì)。
�、垲A(yù)測顯示編碼產(chǎn)物是非酶非跨膜非分泌蛋白質(zhì)，并根據(jù)組成的各類氨基酸分子理化性質(zhì)和比例關(guān)系，推測該編碼產(chǎn)物是分布于細(xì)胞膜表面，通過調(diào)控離子通道達(dá)到調(diào)節(jié)生理功能的作用。
�、芡ㄟ^對其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，預(yù)測在生物體中該蛋白的生理功能是主要參與細(xì)胞中輔酶因子的生物合成、中間產(chǎn)物的代謝和能量代謝。
參考文獻(xiàn)
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