淺析蠟狀芽孢桿菌生物強(qiáng)化反硝化脫氮論文

　　生物強(qiáng)化技術(shù)是向傳統(tǒng)的生物處理系統(tǒng)中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的濃度，增強(qiáng)對難降解污染物的降解能力，提高其降解速率，并改善原有生物處理體系對目標(biāo)污染物的去除效能。目前，生物強(qiáng)化技術(shù)應(yīng)用最為普遍的方式是直接投加對目標(biāo)污染物具有特效降解能力的微生物，當(dāng)原處理系統(tǒng)中不含高效菌種時，如果投入一定量的高效菌種，則可有針對性地去除廢水中的目標(biāo)污染物； 當(dāng)原處理系統(tǒng)中只存在少量高效菌種時，投加高效菌種后，可大大縮短微生物的馴化時間，加快系統(tǒng)的啟動，增強(qiáng)系統(tǒng)的耐負(fù)荷沖擊能力和穩(wěn)定性。筆者從啟動成功并穩(wěn)定運(yùn)行的反硝化反應(yīng)器中富集分離出1 株高效反硝化功能菌，在鑒定該菌株后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用直接投加功能菌法進(jìn)行生物強(qiáng)化研究，對比考察了普通工藝與生物強(qiáng)化工藝從啟動到穩(wěn)定運(yùn)行的反硝化脫氮效果。

　　1 試驗(yàn)材料與方法

　　1。 1 試驗(yàn)裝置

　　試驗(yàn)裝置。采用序批式反應(yīng)器（ 有效容積為15 L） ，考察硝酸鹽為電子受體的反硝化脫氮運(yùn)行效果。瞬時進(jìn)水，通過攪拌器使泥水混合均勻，在運(yùn)行期間保持反應(yīng)器較好的厭氧/缺氧狀態(tài)。試驗(yàn)用活性污泥取自某污水處理廠的沉淀池，該污泥具有初步的脫氮能力，活性污泥不進(jìn)行培養(yǎng)馴化直接投入反應(yīng)器，以厭氧/缺氧方式啟動運(yùn)行，反應(yīng)器每天運(yùn)行3 個周期，每個周期運(yùn)行8 h，其中厭氧180 min、缺氧260 min、排泥排水40 min。r每周期開始瞬時加入含碳有機(jī)合成物5 L，缺氧期開始用恒流泵加入硝酸鈉溶液5 L，硝態(tài)氮濃度從啟動時的40 mg /L 逐漸增大直到穩(wěn)定運(yùn)行。系統(tǒng)MLSS 約為3 000 mg /L，HRT 為16 h，SRT 為30 d，pH 值控制在7。 0 ～ 8。 0。原則上當(dāng)NO —3 — N 去除率> 90% 時，進(jìn)水NO —3 — N 負(fù)荷正常以20 mg /L 遞增，同時兼顧出水水質(zhì)的穩(wěn)定性。反應(yīng)器運(yùn)行過程中，分析檢測運(yùn)行參數(shù)，以便判斷反應(yīng)器運(yùn)行狀況并對其參數(shù)作相應(yīng)調(diào)整。試驗(yàn)對比普通生物脫氮工藝和生物強(qiáng)化脫氮工藝的運(yùn)行狀況，每周期監(jiān)測進(jìn)出水NO —3 — N、NO —2 — N 濃度，每天從3 組數(shù)據(jù)中選擇效果最好的一組作為當(dāng)日的代表數(shù)據(jù)。

　　1。 2 試驗(yàn)水質(zhì)

　　進(jìn)水采用人工合成污水，水質(zhì)成分如下： 葡萄糖（ COD） ，NaNO3（ NO —3 — N） ，KH2PO4為6 mg /L，CaCl2為10 mg /L，MgSO4·7H2O 為90 mg /L，NH4Cl（ NH +4 — N） 為20 mg /L，微量元素溶液為2 mL /L。微量元素成分如下： CuSO4·5H2O 為30 mg /L，KI為180 mg /L，MnCl2·4H2O 為60 mg /L，NaMoO4·2H2O 為60 mg /L，ZnSO4·7H2O 為120 mg /L，CoCl2·6H2O 為150 mg /L，EDTA 為10 g /L。其中COD、NO —3 — N 濃度隨工藝運(yùn)行逐步遞增，基本原則為COD ∶ NO —3 — N = 4 ∶ 1，NaNO3（ NO —3 — N） 在缺氧期加入。厭氧期進(jìn)水pH 值為7。 8 ± 0。 2，缺氧期進(jìn)水pH 值為7。 2 ± 0。 2，以NaHCO3或HCl 調(diào)節(jié)pH 值。普通裝置和生物強(qiáng)化裝置，除進(jìn)水NO —3 — N、COD 濃度不同外，其余運(yùn)行條件全部相同。

　　1。 3 分析項(xiàng)目與方法

　　COD： COD 快速測定儀； 硝酸鹽： 紫外分光光度法； 亞硝酸鹽： N — （ 1 — 萘基） — 乙二胺分光光度法；pH 值： 玻璃電極法。

　　1。 4 生物強(qiáng)化菌種來源

　　生物強(qiáng)化反硝化試驗(yàn)菌種分離自前期穩(wěn)定運(yùn)行的反硝化脫氮污泥。優(yōu)選得到的高效功能菌斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1。 4。 1 菌種分離培養(yǎng)基

　　2。 0 g 的KNO3，5。 0 g 的葡萄糖，1 g 的K2HPO4，1g 的KH2PO4，0。 2 g 的MgSO4·7H2O，15～ 20 g 的瓊脂，1000 mL 的蒸餾水，pH 值為7。 2 ～7。 5， 121 ℃條件下滅菌20 min。

　　1。 4。 2 菌種優(yōu)選

　　將初選出的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后，無菌高速冷凍離心分離，等量接種到裝有200 mL 試驗(yàn)用水的靜態(tài)試驗(yàn)裝置進(jìn)行搖床培養(yǎng)，定時取樣，測定NO —3 — N、NO —2 — N 濃度變化，比較其反硝化能力。由于所篩菌株為后續(xù)生物強(qiáng)化輔助技術(shù)提供菌源，所以靜態(tài)試驗(yàn)水質(zhì)結(jié)合反應(yīng)器實(shí)際運(yùn)行情況，進(jìn)一步提高硝酸鹽濃度，以篩選出脫氮能力強(qiáng)的功能菌。水質(zhì)如下： 葡萄糖（ COD） 為1 000 mg /L，NaNO3（ NO —3 — N） 為400 mg /L，其余成分同1。 2 節(jié)。

　　1。 4。 3 菌株鑒定

　　對優(yōu)選出的代表菌株進(jìn)行其單一菌種的相關(guān)特性研究[5]，在進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行16S rDNA 的序列測定，從分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步鑒定其屬種。

　　1。 5 生物強(qiáng)化研究

　　本試驗(yàn)為生物強(qiáng)化技術(shù)進(jìn)行反硝化脫氮是否可行的初步探討，所以采用操作較為簡單的活化菌液直接投加。每次提高進(jìn)水NO —3 — N 負(fù)荷時投加生物強(qiáng)化優(yōu)勢菌，投加時先將斜面保存的純種優(yōu)選菌株活化后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，再將獲得的擴(kuò)大培養(yǎng)菌液無菌高速冷凍離心分離，最后用無菌水將離心物洗出變成純菌液。菌的含量為108 ～ 109 CFU/mL，每次按處理水量體積的2%投加。

　　2 結(jié)果與討論

　　2。 1 功能菌篩選結(jié)果

　　通過篩選，有7 株菌對目標(biāo)物具有良好的去除效果，該7 株菌分別暫命名為F5Y、FC、FZ、FC1、FRB、FH、FH2。，在電子受體NO —3 — N 濃度為400mg /L 的條件下，培養(yǎng)1 d 后，各菌株對NO —3 — N 的去除能力有很大差異，效果最突出的是FC1 和FH2，對硝酸鹽的去除率分別為87。 5% 和80%，同時，這兩株菌對亞硝酸鹽的積累也很少，硝酸鹽很快被代謝掉。第3 天硝酸鹽就未被檢出，亞硝酸鹽含量也很低，第4 天亞硝酸鹽全部被代謝。菌株FC最終對硝酸鹽的去除效果也很好，期間亞硝酸鹽的積累現(xiàn)象不明顯，但反應(yīng)周期較前兩株菌的要長。通過對比，菌株FC1、FH2 可以將初始濃度為400mg /L 的NO —3 — N 幾乎全部還原，從亞硝酸鹽的還原情況可知，它們對NO —3 — N 的去除建立在將其轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物之上，應(yīng)該具有完整的反硝化酶系，從而表現(xiàn)出了較強(qiáng)的脫氮能力。綜合考慮NO —3 — N的去除率、去除速率以及NO —2 — N 的積累情況，選取菌株FH2 進(jìn)行后續(xù)的研究，該菌株對400 mg /L的NO —3 — N 的去除率可達(dá)100%，且處理時間短，反應(yīng)過程中基本無NO —2 — N 的積累，作為生物強(qiáng)化處理高濃度氨氮廢水的菌源，應(yīng)具有較好的應(yīng)用性。

　　2。 2 生物強(qiáng)化菌株的鑒定結(jié)果

　　2。 2。 1 菌株FH2 的形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果

　　對優(yōu)選菌株FH2 進(jìn)行形態(tài)觀察，結(jié)果顯示，菌體形態(tài)： 桿狀； 菌落形狀： 不規(guī)則； 隆起形狀： 扁平； 邊緣形狀： 毛玻璃狀； 顏色： 淡黃； 透明程度： 不透明； 粘稠度： 不粘。對其進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果表明，革蘭氏染色、芽孢染色、異染顆粒染色、鞭毛染色、硝酸鹽還原、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、觸媒試驗(yàn)、V。 P 試驗(yàn)均呈陽性，莢膜染色呈陰性，兼性厭氧。

　　2。 2。 2 16S rDNA 的序列測定和分析結(jié)果

　　為了進(jìn)一步確定菌株FH2 的屬性，對其進(jìn)行了16S rDNA 序列測定。將測得的序列用Sequcecher軟件進(jìn)行拼接，去掉載體序列以及重復(fù)序列，得到16S rDNA 全序列。全序列以BLAST 軟件在Gen—Bank 中進(jìn)行相似性檢索，得到與菌株序列最相近的菌株，有6 種菌的同源性達(dá)到99%。綜合形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA 的序列測定結(jié)果，鑒定菌株FH2 為蠟狀芽孢桿菌（ Bacillus cereus） 。

　　2。 3 反硝化脫氮工藝的運(yùn)行效果

　　為普通反硝化脫氮工藝和生物強(qiáng)化反硝化脫氮工藝的運(yùn)行效果對比。由圖3 （ a） 可見，在NO —3 — N 濃度為40 mg /L 的條件下啟動普通反硝化脫氮反應(yīng)器，由于活性污泥本身有一定的脫氮能力，第1 天對NO —3 — N 就有少量的去除，在前6 d 出水NO —3 — N 濃度呈逐漸減少的趨勢，并且NO —2 — N 沒有形成大量積累，說明活性污泥對進(jìn)水NO —3 — N 已逐步適應(yīng)； 第7 天開始出水NO —3 — N 濃度明顯減少，此時NO —2 — N 濃度較前一天升高，這可能是因?yàn)槲⑸�物對NO —3 — N 的降解較快，但還未及時將生成的NO —2 — N 轉(zhuǎn)化，第7 天脫氮率達(dá)到76。 65%，反為了穩(wěn)定微生物的反硝化效果，普通脫氮反應(yīng)器在進(jìn)水NO —3 — N 為40 mg /L 的條件下繼續(xù)運(yùn)行了3 d，反硝化效果進(jìn)一步提升，接近100%。在后續(xù)提高進(jìn)水NO —3 — N 負(fù)荷的過程中，每次在提高進(jìn)水負(fù)荷當(dāng)天的出水濃度均波動較大，表明每次提高負(fù)荷均對微生物有一定沖擊，且微生物的數(shù)量可能還暫時不能滿足更高負(fù)荷的要求。在進(jìn)水NO —3 — N濃度為60 ～ 160 mg /L 時，系統(tǒng)對進(jìn)水負(fù)荷提高的適應(yīng)速度較快，基本上從第3 天開始出水水質(zhì)就開始好轉(zhuǎn)，第4 ～ 5 天脫氮率達(dá)90% 以上，出水NO —3 — N濃度較低； 在進(jìn)水NO —3 — N 濃度提高到180 ～ 220mg /L 時，對總氮的去除率影響較小，最終脫氮率均可達(dá)到90%以上，但由于進(jìn)水濃度較高，使得出水濃度也較高； 當(dāng)進(jìn)水NO —3 — N 濃度提高到240 mg /L時，對微生物出現(xiàn)了較大的抑制作用，從第5 天開始出水水質(zhì)逐漸好轉(zhuǎn)，在該負(fù)荷下一共運(yùn)行了10 d，最終脫氮率為95。 53%。為了探究該反應(yīng)器的進(jìn)水NO —3 — N 負(fù)荷極限，將進(jìn)水NO —3 — N 提高到260mg /L 后繼續(xù)運(yùn)行了9 d，在此過程中，脫氮率一直在70%左右，出水NO —3 — N > 60 mg /L、NO —2 — N > 1。 5mg /L。因此，為了保證出水效果，普通反硝化脫氮工藝的進(jìn)水NO —3 — N 濃度不宜超過240 mg /L。生物強(qiáng)化工藝在啟動階段，

　　第1 天沒有明顯的效果，與普通工藝差別不大，但從第2 天開始便有了較好效果，第4 天處理效果很明顯，脫氮率達(dá)到84。 34%，出水NO —3 — N 為5。 45 mg /L、NO —2 — N 為0。 814 mg /L，反應(yīng)器啟動成功，啟動時間較普通工藝有明顯的縮短。當(dāng)進(jìn)水NO —3 — N 在60 ～ 120 mg /L 時，每次20 mg /L 的進(jìn)水NO —3 — N 提高量對工藝運(yùn)行影響極小，微生物很快就能適應(yīng)，達(dá)到理想去除率的時間比普通工藝減少1 d 以上，所以在后續(xù)提高負(fù)荷時每次提高40 mg /L。在生物強(qiáng)化條件下，能達(dá)到理想脫氮效果的進(jìn)水NO —3 — N 濃度最高為340 mg /L，進(jìn)一步提高到380 mg /L 時出現(xiàn)了與普通工藝相似的情況，即使進(jìn)一步投加生物強(qiáng)化菌也未得到改善。在兩個反應(yīng)器中，出水NO —2 — N 濃度一直較低，沒有出現(xiàn)積累，說明系統(tǒng)對NO —3 — N 的去除是建立在將其轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物之上的。對知，生物強(qiáng)化工藝明顯縮短了系統(tǒng)啟動周期，在提高進(jìn)水負(fù)荷時，適應(yīng)時間短、適應(yīng)性強(qiáng)，所能承受的最高進(jìn)水NO —3 — N 濃度比普通工藝提高了100 mg /L，反硝化脫氮能力得到明顯增強(qiáng)，表明采用該菌（ 蠟狀芽孢桿菌） 進(jìn)行生物強(qiáng)化反硝化脫氮能縮短微生物培養(yǎng)馴化時間，迅速提高生物處理系統(tǒng)中微生物的濃度，提高處理效率。

　　3 結(jié)論

　�、� 從穩(wěn)定運(yùn)行的反硝化裝置中優(yōu)選出代號為FH2 的高效反硝化功能菌株，經(jīng)鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌。在靜態(tài)試驗(yàn)中，該菌在NO —3 — N 濃度為400 mg /L 條件下的脫氮率高達(dá)100%，并且代謝速率快，基本沒有亞硝酸鹽的積累，表現(xiàn)出了很強(qiáng)的脫氮能力。

　�、� 與普通反硝化系統(tǒng)相比，投加FH2 菌的生物強(qiáng)化系統(tǒng)的啟動時間明顯縮短，在進(jìn)水負(fù)荷提高時，適應(yīng)時間更短、適應(yīng)性更強(qiáng)，在達(dá)到理想脫氮率時所能承受的最高進(jìn)水NO —3 — N 濃度為340 mg /L，比普通系統(tǒng)提高了100 mg /L，系統(tǒng)的反硝化脫氮能力得到明顯提高。

　�、� 分離得到的蠟狀芽孢桿菌本身的反硝化能力很強(qiáng)，且有芽孢的微生物具有很強(qiáng)的抗逆性，在進(jìn)行生物強(qiáng)化應(yīng)用過程中可抵抗外界不良環(huán)境，適應(yīng)性強(qiáng)，易存活，所以將該菌作為菌源進(jìn)行生物強(qiáng)化反硝化脫氮具有很強(qiáng)的應(yīng)用性。

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