淺談重組糖蛋白激素的生物效價(jià)與質(zhì)量控制論文
已發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素主要是由脊椎動(dòng)物垂體前葉細(xì)胞合成和分泌的促黃體激素、促卵泡激素和促甲狀腺激素，以及胎盤產(chǎn)生的人絨毛膜促性腺激素。被稱為促性腺激素，通過調(diào)節(jié)性腺內(nèi)配子發(fā)生和類固醇激素合成來促進(jìn)辜丸和卵巢的功能，臨床主要用于輔助生殖(促進(jìn)卵泡發(fā)育、成熟及排卵)，治療不孕不育癥，調(diào)節(jié)甲狀腺的生化和生理過程，促使甲狀腺素的合成和分泌，臨床用于該激素缺乏狀況的檢查或替補(bǔ)性短暫維持，在甲狀腺疾病的治療中扮演重要角色，如用于分化型甲狀腺癌的診斷和隨訪，用于刺激清除殘留甲狀腺以及治療甲狀腺癌轉(zhuǎn)移灶，用于刺激治療非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫以及提高低分化甲狀腺癌化療療效等。過去，這類制品來源于垂體或尿液提取物，成分復(fù)雜。現(xiàn)在已實(shí)現(xiàn)基因重組技術(shù)生產(chǎn)，成份單一。重組人LH、重組人FSH、重組HCG和重組人TSH已先后被批準(zhǔn)上市。生物效價(jià)是糖蛋白激素質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，隨著對(duì)高純度重組產(chǎn)品理化結(jié)構(gòu)與生物功能關(guān)系認(rèn)識(shí)的不斷深入和積累，研究發(fā)現(xiàn)糖蛋白激素制品的體內(nèi)生物活性高度依賴糖基化的一致性，因此，現(xiàn)已逐步趨向于以理化指標(biāo)的檢測(cè)代替經(jīng)典的生物活性測(cè)定方法。本文對(duì)影響生物效價(jià)的關(guān)鍵因素、質(zhì)量控制中的關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行梳理回顧，進(jìn)而分析探討糖基化修飾控制對(duì)生物效價(jià)、批間一致性的重要性。
1生物效價(jià)的定義
糖蛋白激素生物效價(jià)量值“單位”是一個(gè)抽象的概念，通過參照標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)其在生物系統(tǒng)(體內(nèi)或體外)產(chǎn)生特定生物反應(yīng)的強(qiáng)弱，確定效價(jià)即生物活性。早期沒有標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，通過測(cè)定其內(nèi)分泌生理功能，定為動(dòng)物單位，如HCG定義1個(gè)鼠單位為可從陰道涂片觀察到雌幼齡大鼠發(fā)情所注射的HCG的量，從絕經(jīng)婦女尿中提取的尿促性腺激素也是相同定義。其缺餡為:沒有特異性，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，無法實(shí)驗(yàn)室之間比較[[9]。因此世界衛(wèi)生組織通過建立國際標(biāo)準(zhǔn)品，確定國際單位，對(duì)第1次或國際參考品通過組織國際間協(xié)作標(biāo)定，最終達(dá)成共識(shí)而定義IU數(shù)值。現(xiàn)在重組糖蛋白激素除:HCG外，rhFSH，rhLH和rhTSH都已有，除rhTSH的是定義的IU外，rhFSH和rhLH的IU由提取的FSH和LH標(biāo)定而來。標(biāo)準(zhǔn)品一般原則為數(shù)值上保持連續(xù)性，由上一次標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定下一次標(biāo)準(zhǔn)品;每一標(biāo)準(zhǔn)品有專門用途，只供生物測(cè)定用或只供免疫測(cè)定用;使用時(shí)遵循“同質(zhì)”原則，如對(duì)rhFSH產(chǎn)品要用rDNA的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，不能用尿源的。標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的建立和溯源是生物效價(jià)量值測(cè)定和賦值的重要基礎(chǔ)，生物制品活性或效價(jià)測(cè)定正是通過生物體外或體內(nèi)試驗(yàn)方法并與標(biāo)準(zhǔn)品或參考品對(duì)照而得，重組糖蛋白激素生物類似藥的研發(fā)過程中，生物活性檢測(cè)被認(rèn)為不僅是產(chǎn)品性質(zhì)研究的一部分、批間分析鑒定的重要檢測(cè)項(xiàng)，同時(shí)也是產(chǎn)品結(jié)構(gòu)確證的有力補(bǔ)充，可反映產(chǎn)品的作用機(jī)制，從而與臨床應(yīng)用聯(lián)系起來。
2糖基化的異質(zhì)性與質(zhì)量控制
糖蛋白激素家族是各由1個(gè)。啞基和1個(gè)p-亞基組成的異質(zhì)二聚體，以非共價(jià)鍵結(jié)合，所有的。-ZL基都是相同的人�；L92個(gè)氨基酸，而和TSH的p啞基氨基酸殘基各不相同糖鏈與膚鏈部分以共價(jià)方式結(jié)合，通常連接在天冬酞胺上，稱為N寡糖側(cè)鏈啞基的C末端比LH延長了24個(gè)氨基酸，稱為竣端膚，其上含有4個(gè)糖鏈連接于絲氨酸殘基，稱為U寡糖側(cè)鏈。重組糖蛋白激素異質(zhì)性也是由于糖基化的不均一導(dǎo)致存在多種異型體，同一種激素，唾液酸含量、糖鏈長度、分枝類型與末端的變化，造成糖蛋白激素分子結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，LH與FSH存在近百種異型體。寡糖側(cè)鏈具有甘露糖,酞葡萄糖胺組成的核心結(jié)構(gòu)，延伸的分支末端有半乳糖、巖藻糖、唾液酸等，糖側(cè)鏈比糖側(cè)鏈更加多樣復(fù)雜化，沒有共同的核心結(jié)構(gòu)唾液酸含量的變化是導(dǎo)致糖基化不均一的關(guān)鍵，重組糖蛋白激素的'活性是由該混合物異型體結(jié)合到靶組織而達(dá)到的效果。指導(dǎo)原則(生物技術(shù)產(chǎn)品和生物制品的檢驗(yàn)方法和可接受標(biāo)準(zhǔn))對(duì)重組糖蛋白的異質(zhì)性，指出“這些異型體可能有活性，不會(huì)對(duì)產(chǎn)品的安全性和有效性產(chǎn)生不利影響，如已證明每批產(chǎn)品的異型體是一致的，就不必對(duì)每一種形式的活性、安全性和有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，這些異型體決定了它們的質(zhì)量，對(duì)異質(zhì)體可當(dāng)作相關(guān)物質(zhì)加以鑒定，確保批與批間一致性”。由此可見批間一致性是質(zhì)量評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。為保證批次間亞型分布的一致性，對(duì)相關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)(降解或聚合物)需進(jìn)行必要的分析。如以反相高效液相色譜對(duì)重組糖蛋白激素進(jìn)行膚圖分析;采用RP}IPLC檢測(cè)。和}-ZL基氧化產(chǎn)物;通過十二烷基硫酸鈉嗜食丙烯酞胺凝膠和排阻高效液相色譜法檢測(cè)游離亞基與多聚體含量;等電點(diǎn)聚焦電泳技術(shù)鑒別亞基分布，檢測(cè)主色帶和等電點(diǎn)范圍等，并與內(nèi)部對(duì)照品比較，對(duì)所有色帶的物質(zhì)進(jìn)行控制�？傊�，控制產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)與物質(zhì)的種類和含量是該類產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，是保證批間一致性的前提。
3糖譜分析及值與效價(jià)關(guān)系
大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)N寡糖側(cè)鏈上唾液酸與糖蛋白激素的等電點(diǎn)、代謝清除率和生物活性密切相關(guān)，唾液酸含量越高，pI越低，生物活性越高，pI與體內(nèi)生物活性間具有高度相關(guān)性(r=0.95}P<0. 01)，以化學(xué)或酶制劑去糖基化后，皆喪失激素活性,LH和HCG去除唾液酸后，雖仍能與受體結(jié)合，具有體外活性，但卻無體內(nèi)活性，因已被從體內(nèi)快速清除。高唾液酸結(jié)構(gòu)，降低了糖蛋白激素的pI，低pI的糖蛋白在體內(nèi)與肝網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性蛋白受體結(jié)合力降低，導(dǎo)致消除率降低，體內(nèi)半衰期延長，如pI=4.27的rFSH比pI =5. 49的半衰期長1倍，而以神經(jīng)氨酸酶去唾液酸后，HCG的半衰期從50 min降至1 min。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究正是基于它們的物理化學(xué)性質(zhì)及對(duì)效價(jià)的影響因素，關(guān)鍵是N梅氰糖側(cè)鏈上唾液酸含量，因0-寡糖側(cè)鏈分子上唾液酸化水平與生物活性的相關(guān)性小圈，因此N寡糖側(cè)鏈的糖基化分析和唾液酸含量是保證重組糖蛋白激素具有生物效價(jià)的關(guān)鍵，糖譜分析是質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，通過與對(duì)照品比對(duì)糖譜，及Z值計(jì)算，確保批間一致性。Z值是一假設(shè)參數(shù)，按不同種唾液酸比例評(píng)價(jià)唾液酸化程度，采用陰離子交換高效液相色譜和熒光檢測(cè)儀分析糖譜，半定量分析相同唾液酸數(shù)量的寡糖百分比，即按糖鏈多聚糖所帶電荷數(shù)，洗脫分離唾液酸化組分為中性唾液酸化組分及單、二、三、四、五唾液酸化組分，各自組分糖所占色譜峰面積除以所有組分糖總面積的百分比(A)乘以其相應(yīng)電荷之和為Z值。由于糖側(cè)鏈上唾液酸無生物活性，故Z值只需計(jì)算N寡糖鏈多聚糖，可通過一種高特異性酶膚N糖昔酶F，選擇性在蛋白質(zhì)N鏈接位點(diǎn)將完整的N}糖鏈作為葡萄糖胺類完整裂解下來，酶解消化釋放出完整的N寡糖側(cè)鏈聚糖。Z值具有高度的準(zhǔn)確性(回收率91%一108 %)和精密度( RSD < 2% )，是特征參數(shù)，代表N寡糖側(cè)鏈上唾液酸化水平，能檢測(cè)出不同生物活性的批次間糖基化的差異，效價(jià)低的Z值小，僅攜帶甘露糖無唾液酸的糖基化結(jié)構(gòu)(Z = 0 ); rhLH和rHCG的Z平均值分別184,15。和150 }zo7，每一產(chǎn)品有其固定Z值范圍，故糖蛋白激素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中Z值不可缺少，如某公司生產(chǎn)的rhFSH產(chǎn)品3年內(nèi)生產(chǎn)的120批Z值在177-200，表現(xiàn)出高度批次間一致性。因此糖譜和Z值成為評(píng)價(jià)糖基化水平和重組糖蛋白激素質(zhì)量、保證其具有生物活性和批間一致性的重要指標(biāo)。
4含量測(cè)定與效價(jià)關(guān)系
根據(jù)ICHQ6B規(guī)定:當(dāng)藥物的物理化學(xué)信息(包括高級(jí)結(jié)構(gòu))可以通過理化方法確定，并能證明與生物活性有相關(guān)性，以及存在完整的歷史生產(chǎn)檔案，含量與生物效價(jià)間形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化值時(shí)，就可以用準(zhǔn)確、精密的理化方法測(cè)定含量(林g或mg)代替生物效價(jià)。是測(cè)定重組促性腺激素蛋白含量的常用方法，精密度高;對(duì)rhTSH則以ELISA法測(cè)定含量。生物效價(jià)與含量之比為比活性，rhFSH ，rhLH ，rHCG比活性分別為>10 000 9 000，大大高于提取產(chǎn)品，并且糖型結(jié)構(gòu)也要簡(jiǎn)單的多。與受體結(jié)合后產(chǎn)生的生理效應(yīng)是重組糖蛋白激素所有異型體的綜合效應(yīng)與制劑的量相關(guān)，受體結(jié)合反應(yīng)依賴產(chǎn)品的準(zhǔn)確劑量，而產(chǎn)品亞型分布、糖基化的一致性是前提。當(dāng)經(jīng)過長期考察批次間高度一致的產(chǎn)品，符合要求時(shí)，如某公司的rhFSH產(chǎn)品，7年內(nèi)多批rhFSH原液，批與批次間高度一致，比活性穩(wěn)定，呈正態(tài)分布，效價(jià)與蛋白含量間存在固定關(guān)系，故以含量標(biāo)識(shí)回，取代在常規(guī)生產(chǎn)檢定中誤差大(RSD 20% )，耗費(fèi)人力、物力，傷害動(dòng)物的體內(nèi)生物檢定方法，以理化分析的方法代替，用于成品的質(zhì)量控制。研發(fā)重組糖蛋白激素生物類似藥企業(yè)，可積累數(shù)據(jù)，在確保批間一致性、工藝穩(wěn)定條件下，使含量測(cè)定成為常規(guī)生產(chǎn)中的質(zhì)量控制方法，而取代生物測(cè)定。
5展望
重組糖蛋白激素現(xiàn)階段表達(dá)于CHO細(xì)胞，已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)條件高度自動(dòng)化、可控性強(qiáng)，純化工藝穩(wěn)定，制品純度和比活性高，如rhFSH純度可達(dá)到>99 %，純度和比活性高(>99%)，未見免疫原性問題報(bào)道。通過生產(chǎn)過程的嚴(yán)格監(jiān)控保證質(zhì)量的穩(wěn)定與批次間的高度一致性。
基于糖蛋白激素的構(gòu)效關(guān)系，實(shí)現(xiàn)在CHO細(xì)胞的共表達(dá)，由此制備的長效rhFSH，商品名:已被批準(zhǔn)上市;另有將FSH與免疫球蛋白的恒定區(qū)片段(Fc)融合，制備融合蛋白，得到長效rhFSH的報(bào)道。通過對(duì)它們的質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)，不斷完善與生物效價(jià)相關(guān)的關(guān)鍵指標(biāo)，來確保產(chǎn)品的一致性。
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