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羊松果體細(xì)胞原代培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究
松果體為哺乳動(dòng)物的重要神經(jīng)內(nèi)分泌器官，產(chǎn)生多種胺類和肽類物質(zhì)，下面是小編搜集整理的一篇探究羊松果體細(xì)胞原代生物特性的論文范文，歡迎閱讀查看。
摘要：體外培養(yǎng)山羊及綿羊的松果體細(xì)胞，觀察其增殖情況和功能狀態(tài)的變化。結(jié)果顯示：山羊、綿羊的松果體細(xì)胞體外形態(tài)及生長(zhǎng)情況相似。細(xì)胞多呈圓形或多角形，細(xì)胞體積有增大趨勢(shì)。采用MTT了法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有明顯的增殖現(xiàn)象，大約于11d達(dá)到高峰，用免疫組織化學(xué)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨細(xì)胞的增殖而增加。表明山羊和綿羊松果體細(xì)胞在體外均增殖旺盛，并能保持體內(nèi)的分泌功能。
關(guān)鍵詞：松果體細(xì)胞培養(yǎng);M9了;5-HT免疫組化
松果體為哺乳動(dòng)物的重要神經(jīng)內(nèi)分泌器官，產(chǎn)生多種胺類和肽類物質(zhì)，其主要分泌物--褪黑素(MT)對(duì)許多器官的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了解松果體的生理價(jià)值，許多學(xué)者采用體外培養(yǎng)技術(shù)研究其細(xì)胞形態(tài)和分泌功能.體外構(gòu)建松果體組織并植入動(dòng)物體內(nèi)成為目前研究的熱點(diǎn)，這些研究有助于深入了解松果體的活動(dòng)特點(diǎn)，為進(jìn)一步調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)松果體細(xì)胞分泌的研究積累材料。
哺乳動(dòng)物松果體細(xì)胞培養(yǎng)早在20世紀(jì)70年代國(guó)外就有報(bào)道，1977年Rowe首次觀察了體外培養(yǎng)大鼠松果體細(xì)胞的形態(tài)，1978年Budat成功檢測(cè)了培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞褪黑素合成和分泌功能。本實(shí)驗(yàn)以山羊和綿羊作為研究對(duì)象，對(duì)其松果體進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察在無(wú)其他因素干擾條件下山羊和綿羊松果體細(xì)胞的形態(tài)變化、增殖過(guò)程和功能狀態(tài)的異同，為研究松果體細(xì)胞分泌特點(diǎn)及改變動(dòng)物繁殖現(xiàn)狀提供依據(jù)。
l材料與方法
1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
DMEM培養(yǎng)液(GIBCO，美國(guó))，M199培養(yǎng)液(sigma，美國(guó))，犢牛血清(sigma，美國(guó))，胰蛋白酶(sigma，美國(guó))，雙抗(武漢亞法)，MTr(sigma，美國(guó))，DMSO(國(guó)產(chǎn)分析純)，兔抗5-HT血清(武漢博士德)，SABC試劑盒(武漢博士德)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德)，自動(dòng)酶標(biāo)儀(Tecan，澳大利亞)，C02培養(yǎng)箱(LAB―LINE，美國(guó))，倒置顯微鏡(Nikon，日本)。
1.2松果體細(xì)胞的體外培養(yǎng)
按伊斯蘭方法屠宰1歲齡健康萊蕪黑山羊6只、小尾寒羊5只，分別進(jìn)行以下步驟：迅速開(kāi)顱取出松果體，冷D-hank昌液沖洗;剪碎后，0.25%膠原酶消化30min，含血清培養(yǎng)液中和，反復(fù)吹打，離心;加完全培養(yǎng)液吹打混勻，按每mL1xl04的細(xì)胞密度分別接種于96孔培養(yǎng)板(分7組，每組6孔)和24孔板(分7組，每組3孔，每孔內(nèi)置一蓋玻片)，放人37℃、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。另外，本
實(shí)驗(yàn)中山羊采用DMEM培養(yǎng)液，綿羊采用M199培養(yǎng)液。
1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖
從培養(yǎng)第3d開(kāi)始，隔日取96孔板內(nèi)一組細(xì)胞，每孔加入MTY15μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入DMSO30gL，吹打至沉淀完全溶解后，在0D570。處測(cè)吸光度值并繪制曲線。
1.45-HT免疫組織化學(xué)方法24孔板每組從第3d開(kāi)始隔日取出細(xì)胞爬片，PBS沖洗，冷95%乙醇固定10min;用正常羊血清在室溫下封閉30rain;加入兔抗5―HT血清(1：100)37℃孵育2h，然后4℃過(guò)夜，PBS沖洗3rainx3;加入生物素標(biāo)記的IgG，37℃30min，PBS沖洗3minx3;SABC復(fù)合物37℃下作用30rain，PBS洗3minx3;DAB鏡下顯色5～10Min;蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片觀察。
2結(jié)果
2.1松果體細(xì)胞的形態(tài)觀察
倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)的山羊、綿羊松果體細(xì)胞形態(tài)相似，大多呈圓形或多角形，x400下觀察呈圓圈狀。培養(yǎng)過(guò)程中都可見(jiàn)到“8”形的細(xì)胞形態(tài)，可能為正處于細(xì)胞分裂期。培養(yǎng)后期，細(xì)胞體積略增大，折光性減弱，但形態(tài)變化不大。另外可見(jiàn)具有長(zhǎng)突起的小膠質(zhì)細(xì)胞(圖1、2)。
2.2MTT檢測(cè)結(jié)果
從表1和圖3可以看出，體外培養(yǎng)的松果體細(xì)胞數(shù)量前7d增長(zhǎng)緩慢，第9d開(kāi)始分裂增殖速度加快，于第11d左右達(dá)到高峰，此后生長(zhǎng)曲線開(kāi)始緩慢下降。
2.3.5-HT免疫組化染色結(jié)果
不同培養(yǎng)時(shí)期都可見(jiàn)細(xì)胞爬片上布滿棕黃色的5-HT陽(yáng)性細(xì)胞，培養(yǎng)后期細(xì)胞的陽(yáng)性反應(yīng)仍然明顯，松果體細(xì)胞多呈圓形或多角形，高倍鏡下細(xì)胞中陽(yáng)性物質(zhì)呈不均質(zhì)分布，細(xì)胞輪廓無(wú)明顯界限，復(fù)染后核位于細(xì)胞中間，呈規(guī)則的圓形(圖4、5)。培養(yǎng)前期隨時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有增加現(xiàn)象;在11d細(xì)胞增殖達(dá)高峰后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化不大。
3討論
1)體外條件下培養(yǎng)山羊、綿羊的松果體細(xì)胞形態(tài)相似，初期呈小圓形、折光性強(qiáng)，后期細(xì)胞逐漸增大、折光性減弱，這與廖華對(duì)大鼠松果體細(xì)胞的報(bào)道基本一致。
2)MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞增殖情況的經(jīng)典方法，酶標(biāo)儀所測(cè)的OD值可反映出細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。從測(cè)量OD值得出的生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)，兩種羊雖在不同培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，但其增殖趨勢(shì)相同，松果體細(xì)胞在培養(yǎng)第9d開(kāi)始增殖，11d左右達(dá)到高峰，隨后增長(zhǎng)緩慢。證明松果體細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下，能保持其增殖能力，細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而在成年動(dòng)物體內(nèi)，松果體細(xì)胞與神經(jīng)元一樣，數(shù)目恒定且很難再生。對(duì)于一特定動(dòng)物來(lái)說(shuō)，隨著年齡的增長(zhǎng)松果體細(xì)胞開(kāi)始退化，同時(shí)也沒(méi)有新生的細(xì)胞出現(xiàn)，因此松果體這一器官將逐漸衰老而無(wú)法發(fā)揮其功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外松果體細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖現(xiàn)象，說(shuō)明體外構(gòu)建松果體組織用于解決細(xì)胞的更新問(wèn)題渴望成為可能。
3)褪黑素是松果體細(xì)胞的主要分泌物，而它是由色氨酸在多種酶的作用下轉(zhuǎn)化而成，因此檢測(cè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的任一中間產(chǎn)物或酶都可反映細(xì)胞的功能狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)采用目前常用的5―羥色胺免疫細(xì)胞化學(xué)染色，因?yàn)?-羥色胺作為MT的前體與MT的分泌有著密切的關(guān)系，可初步判斷松果體細(xì)胞的功能狀態(tài)。我們對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)期的細(xì)胞爬片進(jìn)行抗5―羥色胺免疫細(xì)胞化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)爬片上布滿陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞中含有大量呈點(diǎn)狀的陽(yáng)性顆粒，細(xì)胞多為圓形和不規(guī)則形，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨細(xì)胞總數(shù)的增加而增加。證明體外增殖的松果體細(xì)胞具有合成5-HT，分泌MT的能力。
4)本研究所選的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物山羊、綿羊均為季節(jié)性繁殖動(dòng)物，光周期是影響其生殖活動(dòng)的主要環(huán)境因素。松果體分泌的褪黑素在光周期感受過(guò)程中處于調(diào)控的中心地位，褪黑素主要通過(guò)與下丘腦-垂體―性腺軸的相互作用達(dá)到動(dòng)物生殖周期與環(huán)境光周期的同步變化。實(shí)驗(yàn)證明體外構(gòu)建的松果體組織具有旺盛的增殖和分泌能力，因此可以考慮給動(dòng)物植入新的松果體，并人為控制細(xì)胞的分泌狀態(tài)，延長(zhǎng)動(dòng)物的繁殖季節(jié)，以達(dá)到增加繁殖率的目的。同樣其它季節(jié)性繁殖動(dòng)物如藏羚羊等瀕臨滅絕物種也可采用該方法來(lái)提高種群數(shù)目。通過(guò)本課題的研究，我們可以為人工繁殖稀有動(dòng)物提供一個(gè)新的思路。
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