人組蛋白去乙�；�酶11的克隆表達(dá)與生物信息學(xué)分析

　　組蛋白去乙�；�酶(histone deacetylase,HDAC)是一類蛋白酶,對染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。一般情況下,組蛋白的乙�；�有利于DNA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。

　　摘要：為深入研究人組蛋白去乙�；�酶11(HDAC11)與其他家族成員的差異，對HDAC11進(jìn)行克隆表達(dá)和生物信息學(xué)分析。首先利用PCR 擴增目的片段，將其克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-hdac11在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE 電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明HDAC11在大腸桿菌中有表達(dá)，但主要以包涵體的形式存在。利用生物信息學(xué)軟件對HDAC11的氨基酸序列、理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，結(jié)果表明HDAC11為穩(wěn)定中性蛋白，α-螺旋和無規(guī)卷曲為其主要二級結(jié)構(gòu)元件，有多個磷酸化位點。

　　關(guān)鍵詞：組蛋白去乙�；�酶11 表達(dá) 生物信息學(xué) 克隆

　　乙酰化是組蛋白共價修飾的一種方式。可逆的組蛋白乙�；�修飾發(fā)生在核心組蛋白N端的賴氨酸殘基上，分別由組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙�；�酶(HDACs)催化完成。HAT提高乙�；�水平，相反的HDACs則降低乙酰化水平[1]。HDACs是一個大家族，在哺乳細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)18個成員，根據(jù)其與酵母蛋白同源性被分為四類[2]。Ⅰ類HDACs包括HDAC1-3和HDAC8，與酵母蛋白Rpd3同源， 主要存在于細(xì)胞核中，在各種組織細(xì)胞中都有表達(dá)[3]。Ⅱ類HDACs包括HDAC4-7， HDAC9和HDAC10，與酵母蛋白Hda1 同源，穿梭于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間，只在部分組織中有表達(dá)[4]。Ⅲ類HDACs與酵母蛋白Sir2同源，被稱作Sirtuins。成員有7個：SIRTl-SIRT7[5]， 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都存在。HDAC11是Ⅳ類HDAC的唯一成員[6]。Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類HDAC被稱作經(jīng)典HDACs，經(jīng)典HDACs和Sirtuins催化機制不同：經(jīng)典HDACs為鋅離子依賴性蛋白[7]，Sirtuins為尼克酰胺腺苷酸(NAD)依賴性蛋白[8]。除了組蛋白外HDACs也能作用于非組蛋白，比如轉(zhuǎn)錄因子[9]，從而間接影響這些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的基因的表達(dá)，因此HDACs在調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程中扮演了重要角色。相關(guān)研究表明，HDACs與癌癥的發(fā)生有關(guān)[10]。目前，伏立諾他等HDAC抑制劑(HDACi)作為抗腫瘤藥物進(jìn)入臨床并表現(xiàn)出了良好的治療效果，但是現(xiàn)在大部分的HDACi為廣譜型抑制劑， 廣譜HDACi可能會引起多種副作用，比如凝血障礙、心律失常等[11]，這主要是因為HDACs存在多種亞型，因此針對亞型選擇性的HDACi已經(jīng)成為現(xiàn)在研究的一個熱點。HDAC11是HDAC家族發(fā)現(xiàn)最晚的一個成員，也是研究最少的一個成員，本文通過克隆表達(dá)HDAC11并對HDAC11的序列，二級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測分析希望對以后HDAC11的研究工作提供幫助。

　　一、材料與方法

　　1、材料

　　HDAC11序列(登錄號：NM_024827.3)和引物交由生工生物合成，載體pGEX-6P-1為實驗室保存，大腸桿菌菌株DH(5α)和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司。EcoRⅠ，BamHⅠ和T4連接酶購自fermentas， DNA marker和Protein Marker購自全式金，質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自萊科百奧。

　　2、方法

　　2.1 hdac11基因的擴增

　　利用primer 5.0設(shè)計引物。引物為正向-CG GGATCC ATGCTACACACAACCCAGCTGT ACC，反向-CG GAATTC TCAGGGCACTGCAGGGGGAA，引物交由生工生物合成。以合成的HDAC11序列為模版進(jìn)行PCR擴增，參數(shù)為：94℃預(yù)變性10min; 94℃ 30s， 60℃ 30s， 72℃ 1.5min， 30個循環(huán);72℃終延伸10min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

　　2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

　　將回收的目的片段與pGEX-6P-1載體分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，并將酶切產(chǎn)物按一定比例16℃連接5h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH(5α)感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選陽性克隆，對陽性克隆做雙酶切鑒定和測序鑒定。

　　2.3 重組蛋白的表達(dá)

　　將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，OD600=0.6時，加入IPTG使其終濃度為0.1 mM/L，16℃誘導(dǎo)表達(dá)12h，離心收集菌體。用PBS重懸菌體沉淀，超聲破碎后高速離心，取上清和沉淀制樣跑膠分析目的蛋白的表達(dá)形式。

　　2.4 HDAC11的生物信息學(xué)分析

　　利用ProtParam和Protscale對HDAC11的氨基酸序列及理化性質(zhì)進(jìn)行分析，blast在線分析HDAC11的同源性，SOPMA對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，NetPhos和SUMOplot對其進(jìn)行翻譯后修飾預(yù)測。

　　二、結(jié)果與分析

　　1、目的蛋白的克隆表達(dá)

　　1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

　　構(gòu)建的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和BamHⅠ做雙酶切鑒定，獲得4900bp的載體片段和約1000bp的目的基因片段，結(jié)果表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

　　1. Trans 15K DNA Marker 2-4. 雙酶切產(chǎn)物

　　圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

　　1.2重組蛋白的表達(dá)

　　將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21( DE3)中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后收集菌體， SDS-PAGE 檢測結(jié)果顯示， 加入IPTG誘導(dǎo)后， 轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株總蛋白提取物中出現(xiàn)一條分子量約為65kD 的蛋白條帶， 與重組HDAC11蛋白大小相符， 表明重組表達(dá)載體經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后目的蛋白得到表達(dá)。但HDAC11蛋白主要以包涵體形式存在。

　　1. 菌體總蛋白 2. 裂解后上清 3.裂解后沉淀 4. Protein RulerⅠ

　　圖2 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析

　　2、HDAC11的生物信息學(xué)分析

　　2.1 HDAC11的氨基酸序列及理化性質(zhì)分析

　　ProtParam分析表明HDAC11(UniProtKB： Q96DB2)共含有347個氨基酸殘基，含量較高的是亮氨酸(10.1%)、甘氨酸(8.4%)、纈氨酸(7.8%)和精氨酸(7.8%)，含量較少的氨基酸有半胱氨酸(0.6%)、色氨酸(1.4%)等。將人HDAC11的氨基酸序列與小鼠(UniProtKB/Swiss-Prot： Q91WA3.1)，食蟹猴(UniProtKB/Swiss-Prot： Q9GKU5.2)的HDAC11序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)同源性均達(dá)到90%以上。將人源HDAC11與人源HDAC1-HDAC10蛋白進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明HDAC11與其他HDAC蛋白的同源性均不高，其與HDAC1具有31%的最高同源性，與HDAC5的同源性最低，為21%。HDAC11的分子式為C1763H2786N490O501S10，分子量為39183，酸性氨基酸有44個，堿性氨基酸有44個，理論等電點7.17為中性蛋白。在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為39.1，根據(jù)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)在40以下為穩(wěn)定蛋白的標(biāo)準(zhǔn)推測該蛋白為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為96.05。

　　圖3 HDAC11的氨基酸組成分析

　　2.2 HDAC11的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

　　利用SOPMA在線軟件對HDAC11蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明：該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋的比例最高，達(dá)到37.75%，無規(guī)卷曲次之，為30.26%，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角所占比例分別為19.88%和12.10%。因此α-螺旋和無規(guī)卷曲是該蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)元件。含量最高的α-螺旋主要分布于氨基酸殘基的43-66、76-92、154-170、232-247四個區(qū)域，無規(guī)卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則不均勻地分布于整個蛋白質(zhì)多肽鏈中。

　　h--α-螺旋 e--延伸鏈 t--β-轉(zhuǎn)角 c--無規(guī)卷曲

　　最長豎線：α-螺旋 中長豎線：延伸鏈

　　長豎線：β-轉(zhuǎn)角 最短豎線：無規(guī)卷曲

　　圖4 HDAC11的二級結(jié)構(gòu)分析

　　2.3 HDAC11的翻譯后修飾預(yù)測

　　利用NetPhos對HDAC11蛋白進(jìn)行磷酸化修飾預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白擁有9個絲氨酸，2個蘇氨酸和1個酪氨酸共12個潛在的磷酸化位點。利用SUMOplot對其進(jìn)行SUMO化修飾預(yù)測，結(jié)果表明HDAC11有兩個評分較高的修飾位點，分別為K280和K50。

　　圖5 HDAC11的磷酸化位點分析

　　圖6 HDAC11的SUMO化位點分析

　　三、討論

　　本研究將hdac11基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，目的蛋白有表達(dá)，但是以包涵體的形式存在。外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致形成無活性的包涵體，目前減少包涵體形成主要有兩種策略：① 降低蛋白合成速度比如降低誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度[12];②加入促進(jìn)可溶性表達(dá)的生長添加劑[13]。對于已經(jīng)形成包涵體的蛋白可通過將包涵體蛋白體外復(fù)性得到生物活性蛋白。另外本文利用生物信息學(xué)軟件如ProtParam、ProtScale、SOPMA等對HDAC11的序列，理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析預(yù)測。對HDAC11的氨基酸和理化性質(zhì)分析可知，HDAC11在人、小鼠和食蟹猴中的序列非常保守，而HDAC11與其他家族成員的同源性非常低，相比較而言HDAC11更接近于Ⅰ類HDACs。對HDAC11的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測后發(fā)現(xiàn)無規(guī)卷曲和α-螺旋的比例較高，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)比較松散并隨環(huán)境而改變，常構(gòu)成酶活性部位和蛋白質(zhì)特異的功能部位。另外HDAC11可能存在12個磷酸化位點，已有多篇文獻(xiàn)報道HDAC1-HDAC10的10個蛋白均含有磷酸化位點，比如HDAC1的S421[14]、HDAC6的S1035[15]、HDAC7的T286[16]、HDAC8的S39[17]等，這些修飾可能會影響酶的活性或蛋白的定位。Ⅱa類HDACs在細(xì)胞內(nèi)的定位主要是由核的輸入輸出信號和14-3-3蛋白調(diào)控，HDAC4、5、7、9含有三個保守的14-3-3結(jié)合位點，結(jié)合14-3-3后會以一種磷酸化依賴的方式將HDACs留在細(xì)胞質(zhì)中[17]。比如HDAC4的S350被磷酸化后與14-3-3的結(jié)合力增強[18]，HDAC5的S259和S498被磷酸化后會促進(jìn)蛋白從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)[19]，因此對于Ⅱa類HDACs來說磷酸化影響了蛋白的定位。HDAC1的S421和S423被磷酸化后會促進(jìn)酶活性及與NuRD及SIN3復(fù)合物的相互作用[14]，而HDAC8的S39被磷酸化后會降低酶活性[17]，對于HDAC11來說，磷酸化可能影響了它的酶活性。另外HDAC11還含有潛在的SUMO化修飾位點，對于HDACs家族而言，已有文獻(xiàn)報道HDAC1、3、4、6和9有SUMO化修飾[20，21]，HDAC1的K444和K476被修飾后酶的活性增強[21]，SUMO化可能也影響了HDAC11的活性。

　　四、結(jié)論

　　本研究一方面將該基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中進(jìn)行目的蛋白表達(dá)， 結(jié)果以包涵體形式表達(dá)，另一方面利用生物信息學(xué)軟件分析了該蛋白的氨基酸序列、理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、磷酸化位點等，為進(jìn)一步了解該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能以及組蛋白去乙酰化酶家族成員之間的差異打下基礎(chǔ)。

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