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靈芝菌糠懸濁液培養(yǎng)粉狀畢赤酵母研究
摘 要：通過(guò)混合因子設(shè)計(jì)，以粉狀畢赤酵母最大生物量為參照，比較了在以靈芝菌糠懸濁液為主要成分的液體培養(yǎng)基中，菌糠濃度、菌糠處理方式、玉米粉添加量三者對(duì)粉狀畢赤酵母生長(zhǎng)的影響，初步考察了經(jīng)膨化處理的菌糠和未經(jīng)處理的菌糠之間的區(qū)別，得到了經(jīng)優(yōu)化的靈芝菌糠懸濁液培養(yǎng)基，其最優(yōu)配方為膨化靈芝菌糠0.100 g・mL-1，玉米粉0.010 g・mL-1，經(jīng)由52 h培養(yǎng)后，粉狀畢赤酵母的最大生物量為4.527×1010 CFU・mL-1。
關(guān)鍵詞：菌糠;培養(yǎng)基;膨化;畢赤酵母
在食用菌栽培生產(chǎn)過(guò)程中，產(chǎn)生了大量含有菌絲體的培養(yǎng)基質(zhì)，在栽培結(jié)束后，這種被稱為菌糠(Waste medium of fungi culture，WMFC)的培養(yǎng)基廢料的處理問(wèn)題一直是食用菌栽培中的重要問(wèn)題，尤其在近年來(lái)我國(guó)食用菌栽培的規(guī)模已經(jīng)十分可觀的情況下，產(chǎn)生的廢棄菌糠以萬(wàn)t計(jì)[1]。食用菌菌糠中含有大量來(lái)自于所栽培食用菌菌絲體的多糖和菌體蛋白，以及尚未利用的培養(yǎng)基成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上超越了作物秸稈，甚至于和麩類[2-3]以及玉米粉[4]相當(dāng)。因此，將食用菌菌糠作為微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分，拓展工業(yè)微生物培養(yǎng)基的原料來(lái)源，在實(shí)際生產(chǎn)上具有重要的意義。
由于菌糠來(lái)源于食用菌栽培培養(yǎng)基，大部分營(yíng)養(yǎng)成分已經(jīng)被食用菌所利用，或轉(zhuǎn)化成菌絲成分，或轉(zhuǎn)化為具有化感作用的代謝產(chǎn)物，使得菌糠對(duì)于同種或異種食用菌菌絲體有明顯的抑制作用[5-6]。其中，大部分為食用菌的細(xì)胞壁成分，為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖類物質(zhì)[7]。因此，通過(guò)擠壓膨化處理這種物理手段，對(duì)其菌糠進(jìn)行預(yù)加工，以期改變?cè)械奶穷悺⒗w維類物質(zhì)的組成，并去除化感物質(zhì)，不失為一種廉價(jià)而有效的處理廢棄菌糠的方法。
因此，本研究以靈芝菌糠以及膨化處理后的靈芝菌糠作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料，進(jìn)行培養(yǎng)畢赤酵母的初步研究，為食用菌菌糠的新的利用方式提供理論依據(jù)，并驗(yàn)證膨化處理方式在食用菌菌糠處理方面的可行性。
1 材料和方法
1.1 菌 種
粉狀畢赤酵母Pichia farinosa，編號(hào)FL7，引自天津大學(xué)化工學(xué)院，分離自天津市林業(yè)果樹(shù)研究所實(shí)驗(yàn)基地所采集的食用菌菌糠廢棄物堆肥，使用0.5 mL YEPD液體培養(yǎng)基[8-9]分裝于1 mL聚丙烯離心管中于4 °C冰箱保藏。
1.2 原料及處理
菌糠懸濁液培養(yǎng)基的制備采用以下2種經(jīng)過(guò)不同處理的靈芝菌糠。
普通靈芝菌糠：取赤芝Ganoderma lucidum栽培結(jié)束，子實(shí)體已采收后所余含有菌絲體及剩余培養(yǎng)基之菌糠，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)孔徑為0.25 mm的篩，80 °C烘干至恒質(zhì)量備用。
膨化靈芝菌糠：將普通靈芝菌糠經(jīng)雙螺桿擠壓機(jī)膨化處理后[10]，冷卻并粉碎，過(guò)孔徑為0.25 mm的篩，80 °C烘干至恒質(zhì)量備用。
玉米粉：取超市所售玉米粉過(guò)孔徑為0.25 mm的篩，80 °C烘干至恒質(zhì)量備用。
1.3 培養(yǎng)基
(1)種子培養(yǎng)基。采用YEPD液體培養(yǎng)基作為酵母種子培養(yǎng)基，具體配方如下：蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值 6.0。將上述成分分別溶解于蒸餾水中，調(diào)整pH值并定容后，分裝20 mL加于50 mL廣口三角瓶中，棉塞封口后于121 °C高壓蒸汽滅菌30 min，待冷卻后備用。
(2)測(cè)試培養(yǎng)基。靈芝菌糠懸液培養(yǎng)基測(cè)試選取靈芝菌糠濃度、菌糠處理工藝、輔料玉米粉添加量3因子，設(shè)計(jì)全因子試驗(yàn)，因子和水平及培養(yǎng)基各處理配比見(jiàn)表1，所有處理以及CK對(duì)照組皆設(shè)3個(gè)重復(fù)。 取50 mL廣口三角瓶，除對(duì)照組CK外，按表1中各處理對(duì)應(yīng)的因子和水平加入靈芝菌糠、玉米粉和蒸餾水后，玻棒攪動(dòng)至玉米粉和菌糠均勻分散，不經(jīng)調(diào)節(jié)pH值，棉塞封口后于121 °C高壓蒸汽滅菌30 min，待冷卻后取出，超凈臺(tái)內(nèi)晾干表面殘水后備用。各處理皆設(shè)3個(gè)重復(fù)。
(3)對(duì)照及計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。與種子培養(yǎng)基相同的YEPD培養(yǎng)基作為測(cè)試培養(yǎng)基的對(duì)照組CK，測(cè)試培養(yǎng)基，亦設(shè)3個(gè)重復(fù)，配方及制備方式同1.1。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為YEPD固體瓊脂平板。如上述YEPD液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g・L-1，于121 °C高壓蒸汽滅菌30 min后傾注90 mm平板備用。
1.4 培養(yǎng)方法
種子的制備：取制備好的YEPD液體培養(yǎng)基，以100 μL移液槍接入保藏酵母菌種10 μL，置于恒溫?fù)u床中，160 r・min-1，25 °C培養(yǎng)48 h后立即使用。
測(cè)試培養(yǎng)基的接種：以YEPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)48 h的畢赤酵母菌液作為種子，于超凈臺(tái)上振蕩混勻后以移液槍吸取菌液接入各處理中，每瓶接種10 μL。搖勻后，置于恒溫?fù)u床中，160 r・min-1，25 °C避光培養(yǎng)。
經(jīng)由預(yù)備試驗(yàn)，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[11]，確定培養(yǎng)基中的酵母最大生物量大致出現(xiàn)在培養(yǎng)52 h之后。因此，在酵母培養(yǎng)至第48 h后，每隔約4 h取樣，取樣時(shí)將三角瓶移入超凈臺(tái)中，用振蕩器充分搖勻發(fā)酵液，移液槍吸取10 μL發(fā)酵液注入預(yù)先滅菌并干燥后的1 mL聚丙烯離心管中。各處理及其重復(fù)同一時(shí)間點(diǎn)取樣各1次，并記錄準(zhǔn)確取樣時(shí)間。取樣后重新加棉塞，移入恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述過(guò)程直至各培養(yǎng)基發(fā)酵至72 h。
1.5 計(jì)數(shù)方法
采用梯度稀釋―微量點(diǎn)樣法[12]進(jìn)行酵母活菌計(jì)數(shù)。具體操作如下：將含有取樣樣品的聚丙烯離心管中加入90 μL無(wú)菌蒸餾水，振蕩器充分混勻后即為發(fā)酵液10-1梯度。從此離心管中再取10 μL再加入新離心管中，以移液槍加入90 μL無(wú)菌蒸餾水，以振蕩器充分混勻后即為發(fā)酵液10-2梯度，以此類推至10-15為止。
使用移液槍將上述各梯度稀釋液分別吸取10 μL，按稀釋度的大小順序點(diǎn)樣于1.3所述YEPD瓊脂平板上，不加涂布，任其自然形成稀釋液的圓型斑點(diǎn)。各稀釋度點(diǎn)樣3次重復(fù)。點(diǎn)樣后靜置平皿待稀釋液已被平皿瓊脂表面吸收后，加蓋并標(biāo)記各點(diǎn)樣處所對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)和測(cè)試培養(yǎng)基編號(hào)，放置于25 °C恒溫箱避光靜置培養(yǎng)48 h。
菌落形成后，對(duì)各稀釋梯度斑點(diǎn)中的酵母菌落進(jìn)行手工計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)。為避免系統(tǒng)誤差，僅選取菌落數(shù)量大于3個(gè)小于40個(gè)的稀釋梯度進(jìn)行發(fā)酵液中酵母活細(xì)胞數(shù)的計(jì)算。若有1個(gè)以上的稀釋液斑點(diǎn)滿足上述規(guī)則，則對(duì)比二者之間的比值，若比值小于等于2即取平均數(shù)，若比值大于2則只記錄稀釋倍數(shù)較大、菌落總數(shù)較小的斑點(diǎn);若所有稀釋液斑點(diǎn)中的菌落數(shù)均大于40則以最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算;若菌落數(shù)均小于3則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算;若都不存在菌落則以1乘以最小稀釋倍數(shù)計(jì)算。
以菌落形成單位(colony-forming units，CFU)來(lái)表示活酵母生物量，以CFU・mL-1用以表示各處理發(fā)酵液中的活酵母生物量，計(jì)算公式：
CFU= ×10n
式中，CFU為每毫升發(fā)酵液中的活酵母菌落形成單位，CFU・mL-1;v為點(diǎn)樣樣品體積，mL;N為樣品斑點(diǎn)中的酵母菌落數(shù);n為N所對(duì)應(yīng)的樣品稀釋次數(shù)。
以上所得各處理3個(gè)重復(fù)中各個(gè)發(fā)酵液中平均活酵母數(shù)，按日期匯總后，原始數(shù)據(jù)錄入EXCEL軟件，為計(jì)算方便，將全部數(shù)據(jù)換算成以e為底數(shù)的自然對(duì)數(shù)值ln CFU・mL-1，輸入SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 畢赤酵母的最大生物量
測(cè)試培養(yǎng)基各處理中，畢赤酵母的最大生物量平均值(同處理的3個(gè)重復(fù))如表2。
2.2 方差分析
將表2所述各處理及其3個(gè)重復(fù)所得最大生物量數(shù)據(jù)，錄入統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析。選取因子A為3水平組內(nèi)因子，因子C為2水平組內(nèi)因子，因子B為2水平組間因子，使用一般線性模型的重復(fù)度量模式進(jìn)行方差分析，得到方差分析表如表3。
由表3組間因子與組內(nèi)因子方差分析可見(jiàn)，主效應(yīng)中，因子A靈芝菌糠濃度，因子B菌糠處理方式，因子C玉米粉添加量三者均達(dá)到極顯著(P<0.01)水平，但以上3個(gè)因子的二階交互作用，A×B，即靈芝菌糠濃度×菌糠處理方式;A×C，即靈芝菌糠濃度×玉米粉添加量;B×C，即菌糠處理方式×玉米粉添加量，亦達(dá)到極顯著(P<0.01)水平，因此各因子主效應(yīng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚需要對(duì)各因子進(jìn)行簡(jiǎn)單主效應(yīng)分析。其中，因?yàn)槿A交互作用A×B×C，即靈芝菌糠濃度×菌糠處理方式×玉米粉添加量不顯著(F=3.748，P >0.05)，因此不進(jìn)行各因子的簡(jiǎn)單交互作用和簡(jiǎn)單效應(yīng)分析。
2.3 交互作用和簡(jiǎn)單效應(yīng)分析
在SPSS19.0軟件中的syntax模式即語(yǔ)法模式下，使用EMMEANS命令，手動(dòng)編程對(duì)各因子進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)分析，并對(duì)各因子及水平進(jìn)行兩兩比較。所用代碼見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]，此處不再贅述。將代碼以及數(shù)據(jù)錄入SPSS后，所得結(jié)果整理如表4的各因子簡(jiǎn)單效應(yīng)分析表。
2.3.1 靈芝菌糠濃度與菌糠處理方式的簡(jiǎn)單效應(yīng)分析 由表4中因子A對(duì)因子B的簡(jiǎn)單效應(yīng)分析和兩兩比較可以看出，因子A在A1水平下對(duì)因子B的2個(gè)水平簡(jiǎn)單效應(yīng)顯著，且B2>B1，即在0.010 g・mL-1菌糠濃度下，膨化菌糠要優(yōu)于未處理菌糠;在A2水平下對(duì)因子B簡(jiǎn)單效應(yīng)不顯著，即在0.050 g・mL-1菌糠濃度下，膨化菌糠和未處理菌糠并無(wú)區(qū)別，A3水平下，因子A對(duì)因子B的2水平又出現(xiàn)了簡(jiǎn)單效應(yīng)顯著，同樣B2>B1，即在0.100 g・mL-1菌糠濃度下，膨化菌糠要優(yōu)于未處理菌糠。同時(shí)，在因子B對(duì)因子A的簡(jiǎn)單效應(yīng)分析和兩兩比較可以看出，因子B在B1水平下對(duì)因子A的3個(gè)水平簡(jiǎn)單效應(yīng)顯著，且A3>A2>A1，即未處理菌糠的不同濃度對(duì)酵母的生物量有明顯的影響，且隨菌糠濃度的增大而增大;在B2水平下僅與A3水平簡(jiǎn)單效應(yīng)顯著，A3>A2，A1，即膨化菌糠在0.010 g・mL-1的濃度下和0.050 g・mL-1的濃度下酵母生物量并沒(méi)有區(qū)別，在濃度至0.100 g・mL-1時(shí)，酵母的生物量較低濃度有明顯增加。
綜上，菌糠濃度對(duì)酵母生物量的影響與菌糠的不同處理方式密切相關(guān)，經(jīng)過(guò)膨化處理的菌糠在0.100 g・mL-1濃度下培養(yǎng)的解磷酵母生物量最大。至于在0.050 g・mL-1濃度下為何處理方式不同的菌糠，以及不同處理方式的菌糠在0.010 g・mL-1與0.050 g・mL-1下不存在顯著性差異，一個(gè)可能的解釋是與不同處理的菌糠中所含有的速效/遲效碳源、氮源的比例以及二者不同的碳氮比有關(guān)，但這尚需進(jìn)一步的試驗(yàn)。
2.3.2 靈芝菌糠濃度與玉米粉添加量的簡(jiǎn)單效應(yīng)分析 由表4中因子A對(duì)因子C的簡(jiǎn)單效應(yīng)分析和兩兩比較可以看出，因子A在A1水平下對(duì)因子C的2個(gè)水平簡(jiǎn)單效應(yīng)不顯著，即在0.010 g・mL-1菌糠濃度下，添加玉米粉與否并無(wú)明顯區(qū)別;在A2水平下對(duì)因子C的2水平簡(jiǎn)單效應(yīng)顯著，且C2>C1，即在0.050 g・mL-1菌糠濃度下，添加0.010 g・mL-1玉米粉對(duì)酵母生物量有明顯的促進(jìn);在A3水平下，對(duì)因子C的2水平簡(jiǎn)單效應(yīng)顯著，但相反的C1>C2，即在0.100 g・mL-1菌糠濃度下，添加0.010 g・mL-1玉米粉反而對(duì)酵母生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制，生物量反而減少。同時(shí)，在因子C對(duì)因子A的簡(jiǎn)單效應(yīng)分析和兩兩比較可以看出，因子C在C1水平下對(duì)因子A的3個(gè)水平簡(jiǎn)單效應(yīng)顯著，且A3>A2，A1，即未添加玉米粉的靈芝菌糠，僅在0.100 g・mL-1濃度對(duì)酵母的生物量有明顯的影響，這與因子B對(duì)因子A的簡(jiǎn)單效應(yīng)的結(jié)論相同;在C2水平下因子A的3水平簡(jiǎn)單效應(yīng)顯著，A3>A2，A1，即在添加0.010 g・mL-1玉米粉的情況下，不同濃度的靈芝菌糠對(duì)酵母的生物量仍然隨菌糠濃度的增大而增大。
綜上，玉米粉添加量對(duì)酵母生物量的影響受菌糠濃度的制約，只有在0.050 g・mL-1的菌糠濃度下才有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，這顯然和玉米粉加入后改變了培養(yǎng)基的碳氮比有關(guān)。在添加玉米粉的情況下，酵母的生物量隨靈芝菌糠的濃度增大而增大。
2.3.3 菌糠處理方式與玉米粉添加量的簡(jiǎn)單效應(yīng)分析 因子B在B1水平下對(duì)因子C的2個(gè)水平簡(jiǎn)單效應(yīng)不顯著，即對(duì)未處理菌糠而言，添加玉米粉對(duì)酵母生長(zhǎng)并無(wú)促進(jìn);在B2水平下對(duì)因子C的2個(gè)水平簡(jiǎn)單效應(yīng)顯著，C2>C1，即在膨化菌糠中添加0.010 g・mL-1玉米粉要顯著優(yōu)于不添加的，經(jīng)過(guò)膨化處理的菌糠和玉米粉配合良好，也從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明培養(yǎng)基中的碳氮比和速效遲效碳源氮源的比例，膨化和非膨化的菌糠是不同的。因子C對(duì)因子B的簡(jiǎn)單效應(yīng)分析與上述相同。
3 結(jié) 論
在此試驗(yàn)體系下，靈芝菌糠懸濁液培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為膨化靈芝菌糠0.100 g・mL-1，玉米粉0.010 g・mL-1，蒸餾水，經(jīng)由52 h培養(yǎng)后，粉狀畢赤酵母的最大生物量為4.527×1010 CFU・mL-1，遠(yuǎn)高于YEPD培養(yǎng)基的8.987×109 CFU・mL-1。
兩種不同處理的菌糠在0.100 g・mL-1濃度下培養(yǎng)的解磷酵母生物量最大，在0.050 g・mL-1濃度下對(duì)酵母生物量的影響近似。
玉米粉添加量對(duì)酵母生物量的影響受菌糠濃度的制約，只有在0.050 g・mL-1的菌糠濃度下才有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，在添加玉米粉的情況下，酵母的生物量隨靈芝菌糠的濃度增大而增大。
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