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真菌毒素檢測領(lǐng)域噬菌體展示技術(shù)的運用
噬菌體展示系統(tǒng)是一項選擇技術(shù)，它將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達，以下是一篇關(guān)于噬菌體展示技術(shù)展示運用探究的論文范文，供大家閱讀借鑒。
真菌毒素(mycotoxin)是由真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過1000多種真菌毒素，這些毒素僅由350多種真菌產(chǎn)生。真菌在陸地和海洋均廣泛分布，在熱帶分布最廣，因此污染也最重[1].目前，全球關(guān)于真菌毒素污染的報道日益增多，且受污染的也不局限于大米、玉米、小麥、大麥等主要糧食作物，還有藥用植物、水果、堅果、牛奶等。毒性較強的真菌毒素有玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、伏馬毒素(fumonisins,FB)、黃曲霉毒素(aflatoxins,AFT)、赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、鐮刀菌素(fusarin)、擬莖點霉毒素(phomopsins)、桔霉素(citrinin)等。不同的真菌毒素其致毒機制不同，表現(xiàn)為致癌毒性、細胞毒性、遺傳毒性等多個方面。
由于真菌毒素對人類健康有巨大危害，因此國內(nèi)外科研人員研發(fā)了多種檢測真菌毒素的技術(shù)，主要有儀器確證法和利用免疫學(xué)原理篩選檢測的方法。儀器法主要是高效液相色譜法[2]( HPLC) 、質(zhì)譜分析[3]( MS) 、高效液相色譜-多級質(zhì)譜法[4]等，這些方法顯著的優(yōu)勢是能進行定性和定量分析且靈敏度高，但檢測過程復(fù)雜、耗時、儀器設(shè)備十分昂貴、對實驗室環(huán)境和實驗員技能有嚴格的要求，從而限制了其用于大批量樣品的篩選。利用免疫學(xué)原理進行大批量樣品篩選檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[5]( ELISA) 和免疫層析試紙法[6],因其特異性高、靈敏度強、操作簡單，甚至可以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測而發(fā)展迅猛。但上述方法均使生產(chǎn)人員和操作人員須長期接觸真菌毒素標品，對其健康造成潛在危害，并存在二次污染的隱患。因此，近年來新興的噬菌體隨機肽庫展示技術(shù)( phage display technology) 引起許多學(xué)者關(guān)注，并以此技術(shù)研究毒素的替代品及抗體參與免疫化學(xué)反應(yīng)，建立了相關(guān)的無毒檢測免疫學(xué)體系。
1、噬菌體展示技術(shù)簡介
SMITH[7]在 1985 年首次證實外源 DNA 可以插入絲狀噬菌體基因Ⅲ中，并與 pⅢ蛋白融合展示，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。由于這一技術(shù)具有庫容量大，結(jié)合特異性強等特點，促使科研工作者對噬菌體展示技術(shù)進行了深入的探索研究。
這些研究促進了無毒檢測食品及飼料中真菌毒素體系的發(fā)展及昂貴真菌毒素抗體的替代。
1. 1 噬菌體展示系統(tǒng)的原理
噬菌體展示系統(tǒng)是一項選擇技術(shù)，它將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼這個融合子的DNA則位于該病毒粒子內(nèi)。其原理是基于配體和受體反應(yīng)的親和選擇性[8],即利用展示在噬菌體表面的多肽或重組抗體(配體)與目標抗體或抗原(受體)的親和能力進行淘選(panning),淘選到與受體具有高親和性的、空間構(gòu)象與目標配體結(jié)構(gòu)類似的模擬表位，從而可用這模擬表位取代相應(yīng)的有毒抗原或不易獲得的抗體。常用絲狀噬菌體病毒包括f1、fd和M13三類，其基因組編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白，與噬菌體展示密切相關(guān)的是兩種不同的結(jié)構(gòu)蛋白pⅧ和pⅢ。pⅧ蛋白的N端(1-5氨基酸殘基區(qū)域)為可活動的、外露在噬菌體表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置;pⅢ蛋白最外露的是穿膜區(qū)(N端),因而亦是插入外源基因的理想位置，形成的融合蛋白表達在噬菌體顆粒的表面，不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時也保持了外源基因蛋白的天然構(gòu)象，并可被相應(yīng)的受體所識別。利用固定于固相支持物的靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒�，洗去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目的噬菌體，使得各種靶分子(抗體、酶、細胞表面受體等)的多肽通過體外選擇程序得以快速鑒定。而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導(dǎo)出來。
該技術(shù)實現(xiàn)了基因型和表型的轉(zhuǎn)換。
1. 2 噬菌體展示系統(tǒng)的分類
噬菌體展示系統(tǒng)分為： 絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、T7 噬菌體展示系統(tǒng)、T4 噬菌體與 λ 噬菌體展示系統(tǒng); 其所展示內(nèi)容包括隨機肽段、天然肽段、cDNA、抗體、抗體片段等。根據(jù)展示內(nèi)容所建立的文庫又可分為隨機肽庫、抗體庫、cDNA 文庫等，其中用于篩選真菌毒素的模擬表位和不易獲得抗體的常用文庫分別是隨機肽庫和抗體庫。
1. 2. 1 噬菌體隨機肽庫 隨機肽庫是將編碼外源肽的 DNA 短序列插入到噬菌體編碼外殼蛋白的基因組中，使各種組合的隨機肽段與噬菌體外殼蛋白融合表達于噬菌體顆粒表面，被展示的肽可保持相對獨立的空間構(gòu)象和生物活性。而這特定的空間構(gòu)象和生物活性能模擬小分子抗原，因此隨機肽庫經(jīng)過 3 ~ 4 輪的篩選就能獲得小分子的模擬表位。用于淘選的噬菌體展示肽庫是基于完全隨機的肽庫序列，目前商業(yè)肽庫主要有 7 肽庫( Ph. D. -7) 、12 肽庫( Ph. D. -12) 與環(huán) 7 肽庫( Ph. D. -c7c) 等。隨著研究的深入，為了獲得親和性更好的模擬表位，相關(guān)研究人員分析比較從隨機肽庫淘選到的陽性克隆噬菌體的氨基酸序列，獲得其共有氨基酸序列，然后在共有序列兩側(cè)分布隨機氨基酸殘基構(gòu)建二級肽庫[9-10].從概率論和競爭關(guān)系的角度分析，二級肽庫比隨機肽庫更易篩選到理想的模擬表位[11-12],是解決目前采用噬菌體文庫篩選到的模擬表位與抗體的親和性較低這個瓶頸的一個突破口。
1. 2. 2 噬菌體抗體庫 傳統(tǒng)的免疫檢測抗原的抗體為多克隆抗體和單克隆抗體兩種。多克隆抗體比較易于快速生產(chǎn)，但是它并不適合小分子檢測，非特異性反應(yīng)也較多; 而基于雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體有很高的專一性，但單克隆抗體的生產(chǎn)費時、應(yīng)用昂貴，且傷害動物。而基于噬菌體1抗體的優(yōu)勢又克服了其缺點[13],且為制備小分子抗體提供了有效手段。該技術(shù)能夠?qū)⒖贵w功能片段有效地展示于噬菌體表面，利用靶抗原對噬菌體抗體庫進行親和篩選，從而獲得針對該抗原的重組噬菌體抗體。
目前噬菌體展示技術(shù)可展示單鏈抗體(singlechainvariantfragment,scFv)及基于克隆重鏈抗體可變區(qū)構(gòu)建的只由一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(variabledomainofheavychinofheavy-chainantibody,VHH)等。scFv編碼基因由重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因通過人工合成一條寡核苷酸序列(linker)相連融合表達在噬菌體載體的表面[14].重鏈抗體發(fā)現(xiàn)于羊駝、駱駝及護士鯊等動物體內(nèi)，與普通抗體相比缺少了輕鏈，只保留了對抗原的結(jié)合能力的可變區(qū);基于其構(gòu)建的VHH保留了重鏈抗體的分子量小、物理穩(wěn)定性高、易表達等特點，且親和力高、不易聚集而被廣泛應(yīng)用[15].
2、噬菌體展示技術(shù)在真菌毒素檢測領(lǐng)域的研究與應(yīng)用
噬菌體展示技術(shù)的不斷發(fā)展，為真菌毒素檢測領(lǐng)域的延伸和擴展帶來新的方向。噬菌體展示技術(shù)主要應(yīng)用于篩選真菌毒素的模擬表位和抗真菌毒素的重組抗體。
2. 1 噬菌體模擬表位肽在真菌毒素檢測的研究與應(yīng)用
近幾年科研人員淘選各種真菌毒素模擬表位的工作情況見表 1.獲得的模擬表位可用于ELISA、試紙條、快速試紙法和膠體金快速斑點結(jié)合免疫分析等方法檢測真菌毒素。YUAN 等[16]淘選出 2 個較理想的模擬表位，合成了其中的一條模擬序列 SWGPFPF,用于檢測小麥中 DON,其線性范圍為 100 ~ 10 μg/ml; 同時，將合成多肽做了細胞毒理實驗，結(jié)果表明對細胞沒有明顯的毒害，因此可利用模擬表位肽建立無毒免疫學(xué)檢測體系。HE 等[17-18]將在 2011 年用 7 肽庫篩選到的 1 個模擬表位與在 2014 年用 12 肽庫淘選到的一個模擬表位進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)在膠體金快速斑點結(jié)合免疫分析檢測 ZEN 的臨界值都是 50ng /ml,表明噬菌體展示肽的長度可能對小分子模擬表位的親和性影響較小，決定性因素還是展示肽的序列及其構(gòu)象。黃思敏等[19]
分別用 12 肽庫和 7 肽庫淘選桔霉素的模擬表位，最低檢測限( LOD) 均為 10 ng/ml,進一步證明模擬表位親和性的決定性因素主要是展示肽的序列及其構(gòu)象，與其長短關(guān)系不大。WANG 等[20]對其實驗室生產(chǎn)的單抗所淘選的 AFB1模擬表位與鄧省亮等[21]使用中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)的單抗所篩出的模擬表位進行了比較，結(jié)果顯示前者的最低檢測限和線性范圍比后者提高了 40 倍。除了抗體本身的因素外，前者是使用 10% 甲醇進行競爭性洗脫淘選AFB1模擬表位，而后者使用酸洗脫淘選，表明洗脫試劑對能否淘選到理想的模擬表位也是一個關(guān)鍵影響因素。LIU 等[22]篩出伏馬毒素 B1的模擬表位，將合成模擬表位的 7 個氨基酸偶聯(lián)至 BSA并建立了 ELISA 方法檢測伏馬毒素 B1,結(jié)果顯示無交叉反應(yīng)，與商品化 ELISA 試劑盒和 HPLC 檢測結(jié)果一致，表明模擬表位肽完全可以取代毒素標準品。YU 等[23]
獲得了一個擬莖點霉毒素模擬表位并建立了相應(yīng)的 ELISA 方法，與傳統(tǒng)的ELISA 檢測方法相比檢測靈敏度提高了 100 倍。
同時，近年文獻報道顯示環(huán)肽庫比非環(huán)肽庫淘選出來的模擬表位半抑制率( IC50) 更低，分析其原因可能是成環(huán)的氨基酸序列更能模擬抗原的表位[24].2013 年，HE 等[26]構(gòu)建二級肽庫獲得了 OTA的理想模擬表位。該課題組利用商業(yè) 12 肽庫和環(huán) 7 肽庫淘選獲得陽性克隆噬菌體，分析了這些噬菌體的氨基酸序列，得出共有序列 FQLH,固定共有序列并在其兩側(cè)分布其他任意氨基酸殘基構(gòu)建了二級 12 肽庫; 用這二級 12 肽庫淘選出來的模擬表位建立 ELISA 方法檢測 OTA,結(jié)果顯示檢測 OTA 的 LOD 達到 6 pg/ml,其檢測靈敏度與用商業(yè)肽庫直接淘選的模擬表位建立的 ELISA 方法的 LOD 150 pg/ml 相比極大提高。這些數(shù)據(jù)表明了二級肽庫的優(yōu)越性，因此在隨機肽庫的基礎(chǔ)上構(gòu)建二級肽庫為今后獲得檢測靈敏度更高的真菌毒素模擬表位開辟了一條新途徑。
以上研究顯示，采用噬菌體展示技術(shù)淘選的真菌毒素模擬表位完全可以成為真菌毒素的替代品，用其建立的免疫學(xué)檢測方法檢測靈敏度可能更高且對生產(chǎn)和操作人員的傷害可降到最低�！�1】
2. 2 噬菌體抗體庫在真菌毒素檢測的研究與應(yīng)用
近幾年利用噬菌體抗體庫篩選的抗真菌毒素重組抗體并用其檢測相應(yīng)的真菌毒素的 IC50研究結(jié)果見表 2.YUAN 等[27]獲得了抗 ZEN 的 scFv,用 scFv 建立了 ELISA 檢測 ZEN,結(jié)果顯示與單克隆抗體建立的 ELISA 方法檢測結(jié)果一致，但 scFv與 ZEN 的類似物有更高的交叉反應(yīng)，且不耐受甲醇溶液。ZOU 等[28]淘出的 scFv 與單克隆抗體相比在檢測伏馬毒素 B1的 IC50接近，無交叉反應(yīng)，與 HPLC 對伏馬毒素 B1的回收率實驗結(jié)果相似，適合快速、大量、低成本的檢測伏馬毒素 B1.YANG 等[29]篩到了抗 AFB1的 scFv,表現(xiàn)為與AFB1類似物交叉反應(yīng)低，優(yōu)于傳統(tǒng)的 ELISA 檢測方法; 但與 WANG 等[30]淘選到 AFB1的 VHH相比，VHH 的 IC50更低且能耐受 20% 的甲醇，唯一不足的是與 AFB1類似物交叉反應(yīng)率較高; 分析其原因可能與 VHH 缺少輕鏈更易與小分子抗原結(jié)合有關(guān)。HOUWELINGEN 等[31]篩到了一株與 OTA 類似物無明顯的交叉反應(yīng)、亦能耐受甲醇的 VHH.VHH 重組抗體比 ScFv 重組抗體在檢測真菌毒素時具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，究其原因可能是 VHH 重組抗體僅具有 3 個而不是 6 個互 補 性 決 定 區(qū) 環(huán) ( complementaritydeterminingregion loop,CDR loop) 構(gòu)象。重組抗體具有單克隆抗體相似的檢測靈敏度，且擁有單克隆抗體不具備的價格低、易生產(chǎn)的優(yōu)勢，因此利用噬菌體展示技術(shù)篩選的重組抗體建立相應(yīng)的檢測方法來檢測真菌毒素可以大大降低成本，為更全面地檢測食物鏈中的各個環(huán)節(jié)的污染提供了可能。【2】
3、結(jié)語
真菌毒素對人類健康危害很大，所以加強檢測食物鏈中的真菌毒素的污染是當(dāng)務(wù)之急。然而，目前所報道的真菌毒素的檢測成本高昂、同時對檢測人員及生產(chǎn)人員都存在潛在的危害。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)及其在真菌毒素檢測中應(yīng)用，使得成本低廉且無毒的檢測體系成為當(dāng)今真菌毒素檢測的新手段。但此方法涉及到展示的多肽在體外需要實現(xiàn)正確的折疊才能模擬真菌毒素，因此在實際應(yīng)用中并不能完全替代真菌毒素標品且存在與抗體親和力相對弱的情況。針對上述缺陷，目前已有科研工作者利用計算機軟件進行抗體與模擬表位的分子對接分析，通過對模擬肽中的氨基酸殘基進行替換來提高抗體與模擬肽的親和力及提高肽的穩(wěn)定性。相信科研工作者對噬菌體展示技術(shù)庫的構(gòu)建和淘選方法的不斷探索及多學(xué)科的交叉，必然會克服不足，使利用無毒檢測真菌毒素體系的檢測方法靈敏度更高，特異性更好，成本進一步降低。
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