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真菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域噬菌體展示技術(shù)的運(yùn)用
噬菌體展示系統(tǒng)是一項(xiàng)選擇技術(shù)，它將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，以下是一篇關(guān)于噬菌體展示技術(shù)展示運(yùn)用探究的論文范文，供大家閱讀借鑒。
真菌毒素(mycotoxin)是由真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)1000多種真菌毒素，這些毒素僅由350多種真菌產(chǎn)生。真菌在陸地和海洋均廣泛分布，在熱帶分布最廣，因此污染也最重[1].目前，全球關(guān)于真菌毒素污染的報(bào)道日益增多，且受污染的也不局限于大米、玉米、小麥、大麥等主要糧食作物，還有藥用植物、水果、堅(jiān)果、牛奶等。毒性較強(qiáng)的真菌毒素有玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、伏馬毒素(fumonisins,FB)、黃曲霉毒素(aflatoxins,AFT)、赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、鐮刀菌素(fusarin)、擬莖點(diǎn)霉毒素(phomopsins)、桔霉素(citrinin)等。不同的真菌毒素其致毒機(jī)制不同，表現(xiàn)為致癌毒性、細(xì)胞毒性、遺傳毒性等多個(gè)方面。
由于真菌毒素對(duì)人類健康有巨大危害，因此國(guó)內(nèi)外科研人員研發(fā)了多種檢測(cè)真菌毒素的技術(shù)，主要有儀器確證法和利用免疫學(xué)原理篩選檢測(cè)的方法。儀器法主要是高效液相色譜法[2]( HPLC) 、質(zhì)譜分析[3]( MS) 、高效液相色譜-多級(jí)質(zhì)譜法[4]等，這些方法顯著的優(yōu)勢(shì)是能進(jìn)行定性和定量分析且靈敏度高，但檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)、儀器設(shè)備十分昂貴、對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和實(shí)驗(yàn)員技能有嚴(yán)格的要求，從而限制了其用于大批量樣品的篩選。利用免疫學(xué)原理進(jìn)行大批量樣品篩選檢測(cè)的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[5]( ELISA) 和免疫層析試紙法[6],因其特異性高、靈敏度強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，甚至可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)而發(fā)展迅猛。但上述方法均使生產(chǎn)人員和操作人員須長(zhǎng)期接觸真菌毒素標(biāo)品，對(duì)其健康造成潛在危害，并存在二次污染的隱患。因此，近年來(lái)新興的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)展示技術(shù)( phage display technology) 引起許多學(xué)者關(guān)注，并以此技術(shù)研究毒素的替代品及抗體參與免疫化學(xué)反應(yīng)，建立了相關(guān)的無(wú)毒檢測(cè)免疫學(xué)體系。
1、噬菌體展示技術(shù)簡(jiǎn)介
SMITH[7]在 1985 年首次證實(shí)外源 DNA 可以插入絲狀噬菌體基因Ⅲ中，并與 pⅢ蛋白融合展示，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。由于這一技術(shù)具有庫(kù)容量大，結(jié)合特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，促使科研工作者對(duì)噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行了深入的探索研究。
這些研究促進(jìn)了無(wú)毒檢測(cè)食品及飼料中真菌毒素體系的發(fā)展及昂貴真菌毒素抗體的替代。
1. 1 噬菌體展示系統(tǒng)的原理
噬菌體展示系統(tǒng)是一項(xiàng)選擇技術(shù)，它將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼這個(gè)融合子的DNA則位于該病毒粒子內(nèi)。其原理是基于配體和受體反應(yīng)的親和選擇性[8],即利用展示在噬菌體表面的多肽或重組抗體(配體)與目標(biāo)抗體或抗原(受體)的親和能力進(jìn)行淘選(panning),淘選到與受體具有高親和性的、空間構(gòu)象與目標(biāo)配體結(jié)構(gòu)類似的模擬表位，從而可用這模擬表位取代相應(yīng)的有毒抗原或不易獲得的抗體。常用絲狀噬菌體病毒包括f1、fd和M13三類，其基因組編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白，與噬菌體展示密切相關(guān)的是兩種不同的結(jié)構(gòu)蛋白pⅧ和pⅢ。pⅧ蛋白的N端(1-5氨基酸殘基區(qū)域)為可活動(dòng)的、外露在噬菌體表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置;pⅢ蛋白最外露的是穿膜區(qū)(N端),因而亦是插入外源基因的理想位置，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面，不影響和干擾噬菌體的生活周期，同時(shí)也保持了外源基因蛋白的天然構(gòu)象，并可被相應(yīng)的受體所識(shí)別。利用固定于固相支持物的靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒�，洗去非特異結(jié)合的噬菌體，篩選出目的噬菌體，使得各種靶分子(抗體、酶、細(xì)胞表面受體等)的多肽通過(guò)體外選擇程序得以快速鑒定。而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過(guò)分泌型噬菌體的單鏈DNA測(cè)序推導(dǎo)出來(lái)。
該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的轉(zhuǎn)換。
1. 2 噬菌體展示系統(tǒng)的分類
噬菌體展示系統(tǒng)分為： 絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、T7 噬菌體展示系統(tǒng)、T4 噬菌體與 λ 噬菌體展示系統(tǒng); 其所展示內(nèi)容包括隨機(jī)肽段、天然肽段、cDNA、抗體、抗體片段等。根據(jù)展示內(nèi)容所建立的文庫(kù)又可分為隨機(jī)肽庫(kù)、抗體庫(kù)、cDNA 文庫(kù)等，其中用于篩選真菌毒素的模擬表位和不易獲得抗體的常用文庫(kù)分別是隨機(jī)肽庫(kù)和抗體庫(kù)。
1. 2. 1 噬菌體隨機(jī)肽庫(kù) 隨機(jī)肽庫(kù)是將編碼外源肽的 DNA 短序列插入到噬菌體編碼外殼蛋白的基因組中，使各種組合的隨機(jī)肽段與噬菌體外殼蛋白融合表達(dá)于噬菌體顆粒表面，被展示的肽可保持相對(duì)獨(dú)立的空間構(gòu)象和生物活性。而這特定的空間構(gòu)象和生物活性能模擬小分子抗原，因此隨機(jī)肽庫(kù)經(jīng)過(guò) 3 ~ 4 輪的篩選就能獲得小分子的模擬表位。用于淘選的噬菌體展示肽庫(kù)是基于完全隨機(jī)的肽庫(kù)序列，目前商業(yè)肽庫(kù)主要有 7 肽庫(kù)( Ph. D. -7) 、12 肽庫(kù)( Ph. D. -12) 與環(huán) 7 肽庫(kù)( Ph. D. -c7c) 等。隨著研究的深入，為了獲得親和性更好的模擬表位，相關(guān)研究人員分析比較從隨機(jī)肽庫(kù)淘選到的陽(yáng)性克隆噬菌體的氨基酸序列，獲得其共有氨基酸序列，然后在共有序列兩側(cè)分布隨機(jī)氨基酸殘基構(gòu)建二級(jí)肽庫(kù)[9-10].從概率論和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的角度分析，二級(jí)肽庫(kù)比隨機(jī)肽庫(kù)更易篩選到理想的模擬表位[11-12],是解決目前采用噬菌體文庫(kù)篩選到的模擬表位與抗體的親和性較低這個(gè)瓶頸的一個(gè)突破口。
1. 2. 2 噬菌體抗體庫(kù) 傳統(tǒng)的免疫檢測(cè)抗原的抗體為多克隆抗體和單克隆抗體兩種。多克隆抗體比較易于快速生產(chǎn)，但是它并不適合小分子檢測(cè)，非特異性反應(yīng)也較多; 而基于雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體有很高的專一性，但單克隆抗體的生產(chǎn)費(fèi)時(shí)、應(yīng)用昂貴，且傷害動(dòng)物。而基于噬菌體1抗體的優(yōu)勢(shì)又克服了其缺點(diǎn)[13],且為制備小分子抗體提供了有效手段。該技術(shù)能夠?qū)⒖贵w功能片段有效地展示于噬菌體表面，利用靶抗原對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行親和篩選，從而獲得針對(duì)該抗原的重組噬菌體抗體。
目前噬菌體展示技術(shù)可展示單鏈抗體(singlechainvariantfragment,scFv)及基于克隆重鏈抗體可變區(qū)構(gòu)建的只由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(variabledomainofheavychinofheavy-chainantibody,VHH)等。scFv編碼基因由重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因通過(guò)人工合成一條寡核苷酸序列(linker)相連融合表達(dá)在噬菌體載體的表面[14].重鏈抗體發(fā)現(xiàn)于羊駝、駱駝及護(hù)士鯊等動(dòng)物體內(nèi)，與普通抗體相比缺少了輕鏈，只保留了對(duì)抗原的結(jié)合能力的可變區(qū);基于其構(gòu)建的VHH保留了重鏈抗體的分子量小、物理穩(wěn)定性高、易表達(dá)等特點(diǎn)，且親和力高、不易聚集而被廣泛應(yīng)用[15].
2、噬菌體展示技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用
噬菌體展示技術(shù)的不斷發(fā)展，為真菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域的延伸和擴(kuò)展帶來(lái)新的方向。噬菌體展示技術(shù)主要應(yīng)用于篩選真菌毒素的模擬表位和抗真菌毒素的重組抗體。
2. 1 噬菌體模擬表位肽在真菌毒素檢測(cè)的研究與應(yīng)用
近幾年科研人員淘選各種真菌毒素模擬表位的工作情況見(jiàn)表 1.獲得的模擬表位可用于ELISA、試紙條、快速試紙法和膠體金快速斑點(diǎn)結(jié)合免疫分析等方法檢測(cè)真菌毒素。YUAN 等[16]淘選出 2 個(gè)較理想的模擬表位，合成了其中的一條模擬序列 SWGPFPF,用于檢測(cè)小麥中 DON,其線性范圍為 100 ~ 10 μg/ml; 同時(shí)，將合成多肽做了細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒害，因此可利用模擬表位肽建立無(wú)毒免疫學(xué)檢測(cè)體系。HE 等[17-18]將在 2011 年用 7 肽庫(kù)篩選到的 1 個(gè)模擬表位與在 2014 年用 12 肽庫(kù)淘選到的一個(gè)模擬表位進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)在膠體金快速斑點(diǎn)結(jié)合免疫分析檢測(cè) ZEN 的臨界值都是 50ng /ml,表明噬菌體展示肽的長(zhǎng)度可能對(duì)小分子模擬表位的親和性影響較小，決定性因素還是展示肽的序列及其構(gòu)象。黃思敏等[19]
分別用 12 肽庫(kù)和 7 肽庫(kù)淘選桔霉素的模擬表位，最低檢測(cè)限( LOD) 均為 10 ng/ml,進(jìn)一步證明模擬表位親和性的決定性因素主要是展示肽的序列及其構(gòu)象，與其長(zhǎng)短關(guān)系不大。WANG 等[20]對(duì)其實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的單抗所淘選的 AFB1模擬表位與鄧省亮等[21]使用中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)的單抗所篩出的模擬表位進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示前者的最低檢測(cè)限和線性范圍比后者提高了 40 倍。除了抗體本身的因素外，前者是使用 10% 甲醇進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫淘選AFB1模擬表位，而后者使用酸洗脫淘選，表明洗脫試劑對(duì)能否淘選到理想的模擬表位也是一個(gè)關(guān)鍵影響因素。LIU 等[22]篩出伏馬毒素 B1的模擬表位，將合成模擬表位的 7 個(gè)氨基酸偶聯(lián)至 BSA并建立了 ELISA 方法檢測(cè)伏馬毒素 B1,結(jié)果顯示無(wú)交叉反應(yīng)，與商品化 ELISA 試劑盒和 HPLC 檢測(cè)結(jié)果一致，表明模擬表位肽完全可以取代毒素標(biāo)準(zhǔn)品。YU 等[23]
獲得了一個(gè)擬莖點(diǎn)霉毒素模擬表位并建立了相應(yīng)的 ELISA 方法，與傳統(tǒng)的ELISA 檢測(cè)方法相比檢測(cè)靈敏度提高了 100 倍。
同時(shí)，近年文獻(xiàn)報(bào)道顯示環(huán)肽庫(kù)比非環(huán)肽庫(kù)淘選出來(lái)的模擬表位半抑制率( IC50) 更低，分析其原因可能是成環(huán)的氨基酸序列更能模擬抗原的表位[24].2013 年，HE 等[26]構(gòu)建二級(jí)肽庫(kù)獲得了 OTA的理想模擬表位。該課題組利用商業(yè) 12 肽庫(kù)和環(huán) 7 肽庫(kù)淘選獲得陽(yáng)性克隆噬菌體，分析了這些噬菌體的氨基酸序列，得出共有序列 FQLH,固定共有序列并在其兩側(cè)分布其他任意氨基酸殘基構(gòu)建了二級(jí) 12 肽庫(kù); 用這二級(jí) 12 肽庫(kù)淘選出來(lái)的模擬表位建立 ELISA 方法檢測(cè) OTA,結(jié)果顯示檢測(cè) OTA 的 LOD 達(dá)到 6 pg/ml,其檢測(cè)靈敏度與用商業(yè)肽庫(kù)直接淘選的模擬表位建立的 ELISA 方法的 LOD 150 pg/ml 相比極大提高。這些數(shù)據(jù)表明了二級(jí)肽庫(kù)的優(yōu)越性，因此在隨機(jī)肽庫(kù)的基礎(chǔ)上構(gòu)建二級(jí)肽庫(kù)為今后獲得檢測(cè)靈敏度更高的真菌毒素模擬表位開辟了一條新途徑。
以上研究顯示，采用噬菌體展示技術(shù)淘選的真菌毒素模擬表位完全可以成為真菌毒素的替代品，用其建立的免疫學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度可能更高且對(duì)生產(chǎn)和操作人員的傷害可降到最低。【1】
2. 2 噬菌體抗體庫(kù)在真菌毒素檢測(cè)的研究與應(yīng)用
近幾年利用噬菌體抗體庫(kù)篩選的抗真菌毒素重組抗體并用其檢測(cè)相應(yīng)的真菌毒素的 IC50研究結(jié)果見(jiàn)表 2.YUAN 等[27]獲得了抗 ZEN 的 scFv,用 scFv 建立了 ELISA 檢測(cè) ZEN,結(jié)果顯示與單克隆抗體建立的 ELISA 方法檢測(cè)結(jié)果一致，但 scFv與 ZEN 的類似物有更高的交叉反應(yīng)，且不耐受甲醇溶液。ZOU 等[28]淘出的 scFv 與單克隆抗體相比在檢測(cè)伏馬毒素 B1的 IC50接近，無(wú)交叉反應(yīng)，與 HPLC 對(duì)伏馬毒素 B1的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，適合快速、大量、低成本的檢測(cè)伏馬毒素 B1.YANG 等[29]篩到了抗 AFB1的 scFv,表現(xiàn)為與AFB1類似物交叉反應(yīng)低，優(yōu)于傳統(tǒng)的 ELISA 檢測(cè)方法; 但與 WANG 等[30]淘選到 AFB1的 VHH相比，VHH 的 IC50更低且能耐受 20% 的甲醇，唯一不足的是與 AFB1類似物交叉反應(yīng)率較高; 分析其原因可能與 VHH 缺少輕鏈更易與小分子抗原結(jié)合有關(guān)。HOUWELINGEN 等[31]篩到了一株與 OTA 類似物無(wú)明顯的交叉反應(yīng)、亦能耐受甲醇的 VHH.VHH 重組抗體比 ScFv 重組抗體在檢測(cè)真菌毒素時(shí)具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，究其原因可能是 VHH 重組抗體僅具有 3 個(gè)而不是 6 個(gè)互 補(bǔ) 性 決 定 區(qū) 環(huán) ( complementaritydeterminingregion loop,CDR loop) 構(gòu)象。重組抗體具有單克隆抗體相似的檢測(cè)靈敏度，且擁有單克隆抗體不具備的價(jià)格低、易生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，因此利用噬菌體展示技術(shù)篩選的重組抗體建立相應(yīng)的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)真菌毒素可以大大降低成本，為更全面地檢測(cè)食物鏈中的各個(gè)環(huán)節(jié)的污染提供了可能�！�2】
3、結(jié)語(yǔ)
真菌毒素對(duì)人類健康危害很大，所以加強(qiáng)檢測(cè)食物鏈中的真菌毒素的污染是當(dāng)務(wù)之急。然而，目前所報(bào)道的真菌毒素的檢測(cè)成本高昂、同時(shí)對(duì)檢測(cè)人員及生產(chǎn)人員都存在潛在的危害。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)及其在真菌毒素檢測(cè)中應(yīng)用，使得成本低廉且無(wú)毒的檢測(cè)體系成為當(dāng)今真菌毒素檢測(cè)的新手段。但此方法涉及到展示的多肽在體外需要實(shí)現(xiàn)正確的折疊才能模擬真菌毒素，因此在實(shí)際應(yīng)用中并不能完全替代真菌毒素標(biāo)品且存在與抗體親和力相對(duì)弱的情況。針對(duì)上述缺陷，目前已有科研工作者利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行抗體與模擬表位的分子對(duì)接分析，通過(guò)對(duì)模擬肽中的氨基酸殘基進(jìn)行替換來(lái)提高抗體與模擬肽的親和力及提高肽的穩(wěn)定性。相信科研工作者對(duì)噬菌體展示技術(shù)庫(kù)的構(gòu)建和淘選方法的不斷探索及多學(xué)科的交叉，必然會(huì)克服不足，使利用無(wú)毒檢測(cè)真菌毒素體系的檢測(cè)方法靈敏度更高，特異性更好，成本進(jìn)一步降低。
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