新生SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及分化研究
近年來，神經(jīng)干細(xì)胞的研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，下面是小編搜集整理的一篇相關(guān)論文范文，歡迎閱讀查看。
神經(jīng)干細(xì)胞是存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一群具有多向分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，可以分化形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[1,2].近年來，神經(jīng)干細(xì)胞的研究成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。神經(jīng)干細(xì)胞移植被認(rèn)為是治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病最具前景的方案之一[3].本研究采用新生24小時內(nèi)清潔級SD大鼠作為供體，分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，通過觀察、檢測神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的生物學(xué)特性，為神經(jīng)干細(xì)胞的分化研究提供更多實驗依據(jù)。
1材料與方法
1.1實驗動物
新生24小時內(nèi)清潔2級SD大鼠，購于南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。
1.2主要試劑
DMEM/F12培養(yǎng)基，D-Hank's液(Hyclone)，B27神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑(Gibco),bFGF、EGF(Peproteeh)，多聚賴氨酸(Sigma)，胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。nestin抗體購自Chemi-con公司，NF 200和GFAP抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。臺盼藍(lán)、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供。
1.3實驗方法
1.3.1 NSCs的原代分離培養(yǎng)NSCs的分離：取新生24小時內(nèi)清潔級SD大鼠4只，用75%乙醇消毒頭部后，斷頭處死，在超凈臺內(nèi)以眼科剪逐層剪開頭皮及顱骨后，無菌條件下迅速取出端腦及中腦放入預(yù)冷的D-Hank's液中，去 除 腦 膜 及 血 管 后 剪 碎，加 入0.125%胰酶、0.02% EDTA液4ml,37℃消化20~30min后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基4ml終止消化，輕柔吹打至混懸液后，用400目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1000rpm離心5min,棄去上清，用D-Hank's重復(fù)清洗3遍后，加入完全培養(yǎng)基(含2%B27,20μg/L bFGF,20μg/L EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基)重懸細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后的細(xì)胞每2~3d半量換液，培養(yǎng)6~7d傳代1次。逐漸去除碎片及其他細(xì)胞，分離出NSCs.
1.3.2 NSCs的傳代培養(yǎng)在原代培養(yǎng)第7天，無菌條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，用吸管將沉在瓶底而沒有貼壁的神經(jīng)球收集入離心管，棄去貼壁的細(xì)胞，1500rpm離 心5min,吸去上清液后，加 入NSCs完全培養(yǎng)基，輕柔吹打使神經(jīng)球盡可能分離為單細(xì)胞懸液，計數(shù)后仍以1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。此后每2~3d半量換液，培養(yǎng)6~7d傳代1次。
1.3.3 NSCs的免疫化學(xué)鑒定取生長良好的第3代NSCs克隆球，1×105/ml接種至預(yù)先放置多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片的`24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)8小時，使大部分克隆球貼壁，將蓋玻片取出自然晾干。
PBS清 洗2次，每 次5 min,用4%多 聚 甲 醛 固 定30min后，PBS清洗干凈后以3% H2O2去離子水孵育10min,清洗3次，再以山羊血清封閉液37℃封閉10min.滴加一抗nestin(1∶100),37℃孵育2小時，PBS清洗3次，每次5min,滴加二抗B液37℃孵育20min,PBS清洗3次，再滴加C液37℃孵育15min,具體步驟參照SP試劑盒說明書。
PBS清洗3次后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。對照染色以PBS代替一抗，余相同。
1.3.4 NSCs的誘導(dǎo)多向分化取含生長良好的第3代NSCs克隆球的細(xì)胞懸液，1500rpm離心5min,棄去上清，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)液輕柔吹打為單細(xì)胞懸液后，接種于多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片的24孔板內(nèi)，隨時觀察NSCs分化狀態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)7天后，進(jìn)行GFAP和NF 200的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，方法步驟同nestin.
2結(jié)果
2.1 NSCs形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定倒置顯微鏡下動態(tài)觀察原代培養(yǎng)NSCs,細(xì)胞懸液接種24小時后可見大量單個大小相近的圓形細(xì)胞，細(xì)胞核大，胞質(zhì)較少，折光性較高;2~3d半定量換液后可見較多懸浮生長的形態(tài)不一的細(xì)胞球，呈桑椹狀，每個細(xì)胞球由數(shù)個到數(shù)十個細(xì)胞組成，折光性強(qiáng)，無突起生長;6~7d后，生長成由上百個細(xì)胞組成的大克隆球(圖1a)。神經(jīng)細(xì)胞克隆球經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，神經(jīng)干細(xì)胞特異性表達(dá)的巢蛋白nestin呈強(qiáng)陽性表達(dá)，胞漿呈棕黃色(圖1b).2.2 NSCs的誘導(dǎo)分化將培養(yǎng)第3代的NSCs克隆球用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，12小時后可見到部分NSCs克隆球緊貼細(xì)胞培養(yǎng)瓶，許多偽足樣突起從克隆球中伸出;分化至第3天時，可見許多單個細(xì)胞逐漸從克隆球中遷出，細(xì)胞由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)橛型黄鸬募?xì)胞(圖2)。培養(yǎng)至第7天時，細(xì)胞突起明顯增多，細(xì)胞之間形成廣泛的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。
2.3 NSCs誘導(dǎo)多向分化細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定將NSCs培養(yǎng)至第7天時，細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，采用不同神經(jīng)細(xì)胞特異性抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。
結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記抗體GFAP在多角形胞體分化細(xì)胞的胞漿中呈陽性表達(dá)(圖3a)。此類細(xì)胞從胞體伸出許多長的突起，連成網(wǎng)狀。神經(jīng)元標(biāo)記抗體NF 200在卵圓形胞體分化細(xì)胞的胞漿中呈陽性表達(dá)(圖3b)。該類細(xì)胞發(fā)出突起相對較少，大部分細(xì)胞發(fā)出2個細(xì)胞突起。
3討論
近年來，NSCs已被研究證實廣泛分布于胚胎和成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的若干區(qū)域。胚胎腦的端腦、海馬、紋狀體、中腦、室管膜/室管膜下區(qū)、脊髓和成年腦的腦室下區(qū)、紋狀體、海馬顆粒下區(qū)等已成功分離培養(yǎng)出NSCs[2].NSCs因其具有自我維持、自我更新、可遷徙性、轉(zhuǎn)分化性、低免疫原性、多向分化潛能等生理特性，使其成為基因治療的載體或供體細(xì)胞，且可在Ⅳ型膠原的誘導(dǎo)下分化為平滑肌細(xì)胞參與神經(jīng)組織血管再生，為臨床上脊髓損傷、帕金森病、周圍神經(jīng)損傷后肌肉萎縮的治療等提供了新的思路和方法[4~7].
本研究從新生24小時內(nèi)清潔級SD大鼠的端腦及中腦成功地分離培養(yǎng)了NSCs,NSCs在含有能刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖的生長因子B27、bFGF和EGF無血清培養(yǎng)液中大量增殖，呈懸浮球形生長，并連續(xù)傳代生長，體現(xiàn)NSCs自我維持和自我更新的特性。巢蛋白(nestin)是中間絲蛋白家族的成員，被列為第Ⅵ類中間絲蛋白，該蛋白主要在神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)，可以作為神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞以及胰島前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[8].巢蛋白的表達(dá)是暫時性的，一旦前體細(xì)胞分化成終末分化細(xì)胞 如神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，巢蛋白的表達(dá)便終止[9,10].我們的實驗結(jié)果可見，經(jīng)過傳代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞克隆球nestin呈強(qiáng)陽性表達(dá)，表明了經(jīng)傳代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞克隆球保持了神經(jīng)干細(xì)胞特性。當(dāng)去除神經(jīng)干細(xì)胞增殖的生長因子的作用，NSCs置 于含10%胎牛血清的DMEM/F12培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng)3天 后，NSCs發(fā)生分化，不僅表現(xiàn)為細(xì)胞生長方式發(fā)生改變，由懸浮生長變?yōu)橘N壁生長，而且細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了改變，由圓形分化為卵圓形、多角形等多種形態(tài)的有突起細(xì)胞。隨著細(xì)胞的繼續(xù)分化，細(xì)胞突起明顯增多，分化細(xì)胞之間形成廣泛的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。成熟星形膠1酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)元標(biāo)記抗體NF 200.我們采用免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，GFAP和NF200在分化細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，表明神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化后，部分細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，體現(xiàn)了NSCs的多向分化潛能。
4結(jié)論
通過從新生SD大鼠的腦組織成功分離、培養(yǎng)出NSCs,并且向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元等方向分化，體現(xiàn) 了NSCs自我維持、自我更新和多向分化的基本特征。神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)為后續(xù)神經(jīng)干細(xì)胞的分化研究提供了更多的實驗依據(jù)，對細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究具有重要意義。
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